Основы радиационной биофизики - Кудряшов Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Схема отдельных этапов лучевой инактивации сухих ферментов приведена на рис. III-17. Она нуждается в дальнейших уточнениях.
В последние годы особое внимание уделяют анализу скрытых повреждений, возникающих в облученных белках, и изучению механизмов миграции энергии в макромолекулах.
Миграция энергии излучения
в биологических структурах
Анализ кривых «доза '— эффект» свидетельствует о том, что инактивация фермента может произойти в результате одиночного события потери энергии излучения в любой точке макромолекулы (параметры мишени совпадают с истинными размерами макромолекулы). Теоретический анализ спектра сил осцилляторов молекулы и результаты прямых измерений потери энергии, приходящейся на одно взаимодействие, показывают, что ускоренные заряженные частицы с большой вероятностью переносят к макромолекуле значительные порции энергии, в среднем около 60 эВ. Этого более чем достаточно для разрыва любой химической связи и удаления электрона из молекулы.
Однако при объяснении механизма инактивации фермента в результате одиночного события попадания следует иметь в виду, что определенный тип инактивации (например, утрата субстратной специфичности) может быть связан со структурным повреждением, возникшим не в любом, а, скорее всего, в определенном участке макромолекулы. В то же время представление об одно-ударности процесса инактивации означает, что поглощение энергии в любой точке молекулы однозначно приводит к изменению
ее биологических свойств. Можно было бы думать, что разрыв химической связи, в какой бы точке -макромолекулы он ли произошел, приведет к ее денатурации я потере функциональной активности. Это не всегда так. Для многих ферментов показано, что при дозе ?>37» когда в среднем каждая макромолекула испытывает одиночное попадание, одни функциональные свойства утрачиваются, в то время как другие остаются без изменения (для рибонуклеазы, облученной в дозе ?>з7, отмечена потеря каталитической активности при сохранении способности связывать специфический субстрат). Это подтверждает точку зрения, согласно которой в результате одиночного акта абсорбции энергии -структурное повреждение локализуется в определенном звене макромолекулы, обусловливая специфический характер инактивации.
Возможно, объяснение селективного действия облучения состоит в том, что, хотя первоначальное событие -поглощения энергии с одинаковой вероятностью происходит в любом звене макромолекулы (например, в любой из сотен аминокислот, составляющих фермент), существует возможность миграции поглощенной энергии и ее локализации в определенном «слабом эвене», которое будет претерпевать дальнейшие химические изменения.
Существует ряд ярямых доказательств (миграции энергии возбуждения внутри молекулы и между молекулами.
Термолюминесценция. Суть эффекта состоит в том, что при нагревании молекул, облученных яри температуре жидкого азота, происходит испускание квантов света. Это свечение легко зарегистрировать. Интенсивность свечения зависит от температуры. Для белков, облученных при 77К, максимальная люминесценция наблюдается при 120К. Источником люминесценции трипсина может служить остаток триптофана, к которому переносится энергия, поглощенная остатками тирозина и фенилаланина (механизм такого рода переноса энергии между ароматическими аминокислотами изучен при фотовозбуждении люминесценции). Интересно, что рибонуклеаза не содержит остатка триптофана и ле обладает заметной люминесценцией.
Измерение сигнала ЭПР. Метод электронного парамагнитного резонанса основан на исследовании магнитного поля неспаренного электрона. Характерный для данного радикала сигнал ЭПР возникает в результате взаимодействия магнитного поля неспаренного электрона с магнитными полями окружающих ядер и электронов, т. е. сигнал ЭПР изменяется в зависимости от локализации неспаренного электрона. На рис. III-18 приведен характерный спектр ЭПР белка, облученного яри 77 К, при комнатной температуре. С повышением температуры, как было показано на рис. Ш-15, сигнал ЭПР изменяется от недискретного синглета до характерного спектра, в котором можно выявить сигнал глицинподобного радикала и радикала серы. Убедиться, в этом можно при сопоставлении спектра ЭПР облученного белка и облученного полиглицина или цистина. По мнению ряда ис-
следователей, сразу после облучения происходит неупорядоченное образование электронных «дырок»; свободный электрон или электронная «дырка» мигрируют по белковой молекуле к серосодержащим группам или остаткам глицина, где в результате отрыва атома водорода происходит образование вторичных радикалов, выявляемых после нагревания облученных образцов. Такой механизм миграции энергии предполагает быстрое перемещение электрона (или «дырки») вдоль •белковой молекулы и может обеспечиваться перекрыванием волновых функций пептидных групп через асимметричный атом углерода.
Использование метода ЭПР позволяет выявить межмолекулярный перенос энергии от макромолекулы, поглотившей энергию излучения, к окружающим молекулам. Ранее мы упоминали, что при облучении смеси молекул двух типов суммарный сигнал ЭПР отличается от теоретической суммы спектров ЭПР этих молекул. Еще одно доказательство получено при изучении облученной глицеральдегиддегидрогеназы. В спектре ЭПР этого фермента после облучения не обнаруживается си-
