Основы радиационной биофизики - Кудряшов Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
логических свойств фермента; по одному и тому же критерию, например каталитической активности, различные ферменты обладают неодинаковой радиочувствительностью.
Прямое действие излучения
на нуклеиновые кислоты
Существуют определенные трудности количественного измерения степени инактивации нуклеиновых кислот. Ниже перечислен ряд модельных систем, которые позволяют количественно оценить важнейшие из функциональных характеристик этих макромолекул, и перечислены основные феноменологические данные, полученные при изучении характера инактивации облученных нуклеиновых кислот.
Инфекционность облученных нуклеиновых кислот была изучена в экспериментах с ДНК. и РНК, изолированных из бактериофагов. Термином «инфекционность» обозначают способность вирусной ДНК или РНК индуцировать образование бактериальной клеткой новых полноценных фагов. Методически эксперимент выглядит так: бактерии обрабатывают лизоцимом, и они теряют часть клеточной стенки — образуются сферопласты, которые можно инфицировать нуклеиновой кислотой, выделенной из бактериофага. Если в инфицированной бактерии возникают новые полноценные фаги, то бактериальная стенка разрывается и из лизировавшей бактерии высвобождается 100—200 бактериофагов; количество вирусных частиц, высвободившихся из лизированных сферопластов, в определенных пределах пропорционально количеству молекул ДНК или РНК, сохранивших инфекционные свойства. Так как высвободившиеся фаги лизируют новые сферопласты вблизи места своего возникновения, то на сплошном газоне бактериальных клеток, выращенных на агаре, образуется пятно лизиса — «бляшка» (количество бляшек можно подсчитать визуально), — их число служит количественным критерием инфекционности вирусной нуклеиновой кислоты. Этим методом определяют инактивацию вирусной ДНК в результате облучения. Результаты одного из таких экспериментов приведены на рис. III-3.
Доля молекул ДНК, сохранивших инфекционность, отложена по оси ординат в логарифмическом масштабе, все экспериментальные точки укладываются на прямую, т. е. lnJV/JV0=—ku, кривая «доза—эффект» экспоненциальна.
Трансформирующую активность бактериальной ДНК можно оценить по появлению специфических генетических маркеров у бактерий-реципиентов, «поглотивших» трансформирующую ДНК, донора. Например, извлекают ДНК из бактерии, устойчивой к стрептомицину, и в ее присутствии инкубируют стрептомицинчув-ствительных мутантов. Если в результате рекомбинации произошло встраивание специфической последовательности нуклеотидов ДНК донора в геном реципиента, т. е. мутанты стали устойчивы
к стрептомицину (генетический маркер), то на среде, содержащей стрептомицин, мутанты будут образовывать колонии. Число колоний пропорционально доли молекул ДНК, сохранивших трансформирующую активность.
На рис. III—4 показаны результаты опытов, в которых изучали трансформирующую активность ДНК после облучения электронами с энергией в 1 МэВ. Для этого сухие споры Bacillus sub-
tilis подвергали облучению, затем выделяли ДНК и инкубировали с клетками, не способными синтезировать индол (генетический маркер); зависимость «доза—эффект» экспоненциальна.
Рис. III—3. Инфекцион-иость ДНК фага фХ174 после облучения препарата у-лучами в0Со в вакууме (по Юнгу, 1968)
Доза облучения, X 10 Гр
Рис. III—4. Инактивация трансформирующей ДНК Bacillus sub-tilis при облучении сухих спор электронами с энергией 1 МэВ (по Танукэ и Хатчинсону, 1967)
Затравочная активность ДНК, т. е. ее способность служить матрицей для синтеза комплементарных нитей ДНК или РНК, также служит важным критерием инактивации нуклеиновых кислот ионизирующим излучением. Путем соответствующей постановки эксперимента можно дифференциально оценить способность ДНК служить матрицей для синтеза ДНК или РНК. Для этого облученную ДНК инкубируют в полной ДНК-полимеразной (или РНК-полимеразной) системе, содержащей меченые нуклео-зидтрифосфаты, а затем измеряют индекс метки в кислотонерастворимой фракции. Интересно, что для подавления способности молекул ДНК служить матрицей для синтеза ДНК необходима доза облучения, в 40 раз меньшая, чем для синтеза комплементарных РНК. Это можно объяснить, если учесть, что в первом случае транскрибируется вся матрица, а во втором — только ее ограниченные участки.
Способность ДНК образовывать гибриды с иРНК также позволяет количественно оценить инактивацию ДНК в результате облучения. Для проведения такого эксперимента получают РНК, меченную радиоактивным фосфором, затем ее смешивают с предварительно облученной ДНК и инкубируют смесь в определенных
Таблица III-2
Сравнительная радиочувствительность различных тРНК, (способность связывать соответствующие аминокислоты)
(по данным Сэтлау и др., 1964)
Изученный комплекс: Divr Х10* Гр Изученный комплекс: 2>3„ Х10‘ Гр
аминокислота/тРНК аминокислота/тРНК
Лейции 25 Пролии 58
Алании 43 Метионии 62
Изолейцин 46 Валин 86
