Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел - Корниенко И.В.
ISBN 5-7509-0904-2
Скачать (прямая ссылка):
Таблица 4 Селективность Челекс 100 в отношении
дивалентных катионов
Hg2 + 1060 Fe2+ 0,130
Cu2+ 126 Mn2+ 0,024
Ni2+ 4,40 Ba2+ 0,016
Pb2 + 3,88 Ca2 + 0,013
Zn2+ 1,00 Sr2 + 0,013
Co2+ 0,615 Mg2+ 0,009
Cd2 + 0,390 Na+ 0,0000001
Степень селективности Челекса зависит от pH (рис. 5), ионной силы, а также от наличия других комплексообразователей. Так в случае ацетатного буфера с pH 5 ряд селективности будет выглядеть следующим образом:
Pd2+ >Cu2+ »Fe2+ >Ni2+ >РЬ2 + >Мп2 + »Са2 + >
>Mg2+>»Na+.
В водных растворах с pH 4 картина несколько меняется:
Hg2 + >Cu2+>Pb2+ »>Ni2+ >Zn2+ >Cd2+>Co2+>
> Fe2 + >Mn2 + >Ca2 + >»Na+.
Процедура выделения включает в себя нейтрализацию металосодержащих соединений и протеинов путем кипячения образца в присутствии Chelex 100; лизат непосредственно добавляют в ПЦР смесь.
ОБРАЗЕЦ:
Пятно крови диаметром 1-3 мм2.
1. Из пятен крови на FTA-картах пробойником вырезать фрагменты из участков, расположенных как можно ближе к центру пятен. Фрагменты перенести в микро-центрифужные пробирки.
2. В каждую пробирку добавить по 1000 мкл деионизованной воды.
3. Инкубировать 15 минут при комнатной температуре. Встряхнуть.
4. Центрифугировать 5 минут при 10000 v об/мин.
5. Удалить 980 мкл супернатанта.
6. В каждую пробирку добавить по 150 мкл 5% суспензии Chelex 100 и по 50 мкл раствора протеиназы К (2 мг/мл). Когда отбирают Chelex, взвесь должна быть однородной. Для этого во время отбора суспензию Chelex необходимо перемешивать на магнитной мешалке. Использовать наконечники к автоматическим пипеткам с широким отверстием.
7. Инкубировать 15-30 минут (лучше 12-14 часов) при +5б°С.
8. Перемешать на вортексе в течение 5-10 секунд.
9. Пробы инкубировать в кипящей водяной бане или в термостате с ячейками при температуре 100 °С в течение 8 минут.
10. Перемешать на вортексе в течение 5-10 секунд.
11. Центрифугировать в течение 2-3 минут при 10000 - 15000 об/мин.
12. Для постановки ПЦР используют супернатант. ДНК, очищенная с помощью Chelex 100, является одноцепочечной, поэтому оценить количество и качество выделенной ДНК при помощи методов, где используются интеркалирующие красители, например, бромистый этидий, нельзя.
13. Остатки супернатанта хранят при температуре 2 - 8° С или при -20° С (длительное хранение).
14. При повторном использовании производят действия, указанные в пп. 9-11.
4. Выделение ДНК из пятен крови с помощью
ионообменной смолы Chelex 100
ПРИНЦИП:
Основная процедура выделения включает в себя очистку от металлосодержащих соединений и протеинов с последующим кипячением образца в присутствии Chelex 100, затем супернатант непосредственно добавляют в ПЦР смесь.
OKPA3EU:
3-5 мкл цельной крови или пятно крови диаметром 1-5 мм.
1. В микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл внести 1 мл стерильной дистиллированной воды. Добавить 3-5 мкл жидкой крови или фрагмент носителя с сухой кровью, перемешать.
2. Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут, периодически перемешивая. В случае сухой крови инкубацию можно удлинить.
3. Центрифугируют в течение 2-3 минут при 10000 - 15000 об/мин.
4. Удалить 970 — 980 мкл супернатанта, оставив в пробирке приблизительно 20-30 мкл. При исследовании пятна в пробирке с осадком оставляют также предмет-носитель.
5. Добавить 5% взвесь Chelex до конечного объема 200 мкл. Когда отбирают Chelex 100, взвесь должна быть однородной. Для
у этого во время отбора Chelex перемеши-
4
вают на магнитной мешалке. Использовать наконечники к автоматическим пипеткам с широким отверстием.
6. Инкубировать при температуре 56°С в течение 15-30 минут.
7. Перемешать на вортексе в течение 5-10 секунд.
8. Пробы инкубировать в кипящей водяной бане или в термостате с ячейками при температуре 100°С в течение 8 минут.
9. Перемешать на вортексе в течение 5-10 секунд.
10. Центрифугировать в течение 2-3 минут при 10000 - 15000 об/мин.
11. Для постановки ПЦР используют супернатант. ДНК, очищенная с помощью Chelex 100, является одноцепочечной, поэтому оценить количество и качество выделенной ДНК при помощи методов, где используются интеркалирующие красители, например, бромистый этидий нельзя.
12. Остатки супернатанта хранят при температуре 2 - 8°С или при -20°С (длительное хранение).
13. При повторном использовании производят действия, указанные в пп. 9-11.
5. Выделение ДНК из жидкой крови методом экстракции органическими реагентами
ПРИНЦИП МЕТОДА:
При выделении ДНК используются органические растворители. В основе метода лежит лизис неядерных клеток крови (эритроцитов) под действием раствора хлорида и цитрата натрия (IX SSC). После удаления разрушенных неядерных клеток белые клетки крови лизируют доде-
цил сульфатом натрия (SDS), деградация белков осуществляется протеиназой К. Лизат белых клеток обрабатывают смесью фенол/хлоро-форм/изоамиловый спирт. Фенол удаляет из водной фазы белки, а хлороформ — остатки фенола, изоамиловый спирт является пеногаси-телем. ДНК получают преципитацией с использованием холодного этанола, а затем растворяют в Трис-ЭДТА (ТЕ) буфере.
