Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел - Корниенко И.В.
ISBN 5-7509-0904-2
Скачать (прямая ссылка):
Стабильность образцов ДНК в дальнейшем обеспечивалась помещением FTA-карточки в Fitzco мульти-барьерный мешок (конверт, состоящий из семи слоев, включая слои фольги, полиэфира, бумаги и полиэтилена; десикант (силикагель) может вкладываться вовнутрь конверта) и в полностью ламинированный пакет. Эта система упаковки позволяет сохранить целостность ДНК путем предохранения образца крови от воздействия озона, ультрафиолетового излучения и изменений влажности. Комбинация FTA-карточки и усовершенствованной упаковки позволяет полностью устранить необходи-
мость хранения образца крови при низкой температуре.
При помещении крови на FTA-бумагу клеточные элементы подвергаются лизису. ДНК высвобождается из ядер лейкоцитов и иммобилизуется на матриксе бумаги. Связанная таким образом ДНК может быть освобождена от гема или других ингибиторов ПЦР простым отмыванием, после чего FTA-бумага с иммобилизованной на ней ДНК может вводиться непосредственно в соответствующую амплификационную смесь.
2. Очистка ДНК, иммобилизованной на FTA
Gene Guard системе, от ингибиторов ПЦР
ПРИНЦИП:
Связанную ДНК освобождают от гема и других ингибиторов ПЦР с помощью специального FTA-реагента для отмывки. В течение всей процедуры очистки ДНК остается связанной с твердым носителем, который затем непосредственно вносится в ПЦР-смесь.
ОБРАЗЕЦ:
Пятно крови, диаметром 1-3 мм.
1. Из пятен крови на FTA-картах пробойником вырезать фрагменты из участков, расположенные как можно ближе к центру пятен. Фрагменты перенести в соответст-
вующие 1,5 мл микропробирки типа Эп-пендорф (или любую другую пробирку вместимостью, как минимум, 300 мкл).
ВНИМАНИЕ: Поскольку ДНК связывается с FTA-бумагой очень прочно, то нет никакой необходимости промывать пробойник перед каждым использованием, однако очень важно убедиться, чтобы частицы бумаги не переносились от предыдущей пробы к последующей, поэтому желательно обработать пробойник ватой (или щеточкой), смоченной спиртом.
2. Добавить 200 мкл FTA-реагента для очистки в каждую пробирку, закрыть крышку, встряхнуть на вортексе 1-2 секунды при медленной скорости.
3. Инкубировать 5 минут при комнатной температуре, слегка встряхивая.
4. После 5-минутной инкубации тщательно удалить максимально возможный объем реагента. FTA-реагент может быть удален либо пипеткой, либо декантацией таким образом, чтобы фрагмент носителя остался в пробирке. Избыток жидкости удалить при помощи бумажной салфетки, типа « Kim wipe ».
5. Повторить дважды этапы 2 и 3.
6. После удаления FTA-реагента для очистки в пробирки добавить 200 мкл ТЕ-буфера, закрыть крышкой, встряхнуть на вортексе 1-2 секунды при медленной скорости. Инкубировать 5 минут.
7. Удалить ТЕ-буфер.
8. Повторить п. 6 еще раз.
9. Удалить ТЕ-буфер, оставить пробирку открытой. Хорошо высушить фрагмент FTA-бумаги на открытом воздухе (примерно один час). В качестве альтернативы процесс сушки может быть ускорен инкубацией при 60°С в течение 30 минут.
10. Высушенный фрагмент FTA-бумаги непосредственно вносится в ПЦР-смесь (рекомендуемый объем 50 мкл).
3. Выделение ДНК, иммобилизованной на FTA Gene Guard системе с помощью ионообменной
смолы Chelex 100 и протеиназы К
\
ПРИНЦИП:
Chelex 100 является анионообменной смолой, которая, благодаря отрицательно заряженным иминодиацетатным реакционным центрам, имеет высокую аффинность к поливалентным ионам металлов. Полная обменная емкость для натриевой ионной формы Chelex 100 составляет для (Н) — 3,7 мг-экв/г, для (Си) — 2,9 мг-экв/г. Максимальная рабочая температура — +75°С. В присутствии Chelex 100 при кипячении проб предотвращается деградация ДНК вследствие связывания ионов металлов, вызывающих разрушение полинуклеотидной цепи под действием высокой температуры в условиях низкой ион-
ной силы или за счет активации нуклеазнои активности.
Челекс 100 представляет собой сополимер стирола и дивинилбензола, содержащий парные иминодиацетатные группы, действующие как хелаты, связывая поливалентные ионы металлов. Челекс имеет необычайно высокое сродство к меди, железу и другим тяжелым металлам. Селективность Челекса к двухвалентным ионам приблизительно в 5000 раз превышает способность связывать моновалентные ионы, что позволяет успешное его использование даже в растворах с высокой ионной силой.
Челекс 100 устойчив в широких диапозонах pH и сохраняет функциональную активность при pH среды от 2 до 14. Вследствие того, что способность хелатировать ионы металлов определяется иминодиацетатными группами, активность Челекса сильно зависит от рн среды (рис. 7).
?Н2СООН (|Н2СООН ун2соо j:H2COO
r-ch2-nh+ r-ch2-nh+ r-ch2-nh+ r-ch2-n
III I
CH2COOH CH2COO CH2COO CH2COO
PH 2,21 -^ pH 3,99 -^ pH 7,41-^ pH 12,30
Рисунок 7: Изменение поверхностного заряда Челекс 100 в зависимости от pH среды.
4. Зак. 577
97
Устойчивость комплексов Челекс — Металл прежде всего определяется природой металла. В таблице 4 представлены значения селективности для ряда двухвалентных катионов.
