Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел - Корниенко И.В.
ISBN 5-7509-0904-2
Скачать (прямая ссылка):
экстракции органическими реагентами......158
16. Выделение ДНК из мягких тканей с
помощью ионообменной смолы Chelex 100.....160
17. Выделение ДНК из мягких тканей с помощью ионообменной смолы Chelex 100 и
протеиназы К..............................162
18. Экстракция ДНК из различных биологических источников с помощью
набора PROTRANS Forensic Kit I............164
19. Концентрирование и очистка экстрактов ДНК при помощи устройства «Centricon 100». 168
V. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ ФИКСИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ..........................
174
20. Депарафинирование фрагментов тканей... 175
21. Выделение ДНК из депарафинированных
v 4 *"1 С
тканей.............................. .....1 /о
VI. КАЧЕСТВЕННАЯ И КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА ВЫДЕЛЕННОЙ ДНК......................,...178
22. Спектрофотометрическая детекция
нуклеиновых кислот.........................179
23. Количественная оценка выделенной ДНК
на флуориметре Hoefer DyNA QuantTM 200. ..183
23. Количественное определение ДНК человека в растворе с помощью тест-набора
QuantiBlot® Human DNA Quantitation Kit....188
24. Оценка качества ДНК при помощи
электрофореза в агарозном геле.............197
25. Фотодокументирование результатов
электрофореза в агарозном геле.............201
Приложение 1
Меры предосторожности при работе с биологическим материалом..................212
Приложение 2
Оборудование, необходимое для экстракции
ДНК........................................215
Приложение 3
Реагенты для экстракции ДНК................217
Приложение 4
Растворы для экстракции и анализа выделенной ДНК............................219
Приложение 5
Меры безопасности при работе с опасными химическими реактивами....................231
Приложение 6
Хранение реактивов.........................245
ВВЕДЕНИЕ
Проведение военных действий в районах локальных конфликтов, техногенные и прочие катастрофы повлекли за собой поступление значительного числа обезличенных человеческих останков, не подлежащих визуальному опознанию. Необходимость идентификации личности в условиях массового поступления неопознанных тел стимулировала использование современных молекулярно-генетических методов в судебнокриминалистической практике.
Классические методы идентификации личности, основанные на сравнительном анализе морфологических признаков, изучении мине-
U
рального состава костей скелета и применение других специальных технологий, имеют предел идентификационных возможностей. С развитием методов молекулярной генетики появилась перспектива существенно расширить возможности судебно-медицинской идентификации посредством использования методов ДНК-анализа. В 1985 году Джеффрисом был предложен первый метод, позволяющий проводить генетическую идентификацию биологических объектов судебной экспертизы, получивший название «геномная дактилоскопия» по аналогии с классической дактилоскопией [1, 2]. Этот подход ос-
р
нован на существовании в геноме человека ги-первариабельных районов (ГВР) ДНК, обладающих свойствами структурного полиморфизма и
существующих в виде разбросанных по всему геному семейств [3, 4). Визуализация сложного набора ГВР-полос заключает в себе уникальную для данного индивидуума картину геномного «дактоотпечатка» [5].
В настоящее время исходный метод «отпечатков пальцев ДНК» практически вытеснен другим, намного более чувствительным и специфичным методом оценки профилей ДНК, основанным на использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР) [6, 7). Теоретически метод ПЦР позволяет проводить анализ нужного локу-са ДНК, даже если его концентрация в пробирке составляет всего 1,6610'24 М (т.е., одна молекула).
Исследование состоит из следующих этапов: выделение ДНК из объекта, амплификация (увеличение количества копий) и последующий анализ гипервариабельных участков ДНК, которые строго специфичны для каждого индивидуума и могут служить индивидуализирующими личность признаками [8, 9]. Вариант молекулярногенетического идентификационного анализа, в основе которого лежит феномен полиморфизма длины амплифицированных фрагментов ДНК, является одним из наиболее перспективных в плане судебно-медицинского исследования вещественных доказательств [10, 11].
Высокая чувствительность ПЦР-анализа выдвигает жесткие требования к правилам выделения ДНК из биологического материала, по-
^ 1. Зак. 577 9
этому большое внимание следует уделять методам экстракции и очистки ДНК. Необходимо индивидуально подбирать соответствующую методику в зависимости от вида объекта, его состояния и вида ткани. Для использования ДНК в идентификационных целях необходимо прежде всего получить ее в чистом виде, свободном от нуклеаз и сопутствующих примесей (белков, железосодержащих соединений и т.д.). ПЦР-методы базируются на образовании специфического продукта (амплификона) ферментом ДНК-полимеразой на специфической ДНК-матрице in vitro. Поэтому ДНК-матрица должна быть абсолютно доступна для работы полимеразы (свободна от белков), не должна быть повреждена и в реакционной среде не должны присутствовать ингибиторы реакции [12, 13].
