Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Корниенко И.В. -> "Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел" -> 17

Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел - Корниенко И.В.

Корниенко И.В., Водолажский Д.И., Вейко В.П., Щербаков В.В., Иванов П.Л. Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел — Ростиздат, 2001. — 256 c.
ISBN 5-7509-0904-2
Скачать (прямая ссылка): podgotovkabiologmateriala2001.djvu
Предыдущая << 1 .. 11 12 13 14 15 16 < 17 > 18 19 20 21 22 23 .. 53 >> Следующая

2. Любые лабораторные поверхности, все автоматические пипетки и штативы, используемые для выделения ДНК, должны быть обработаны 7 мМ NaOCl и тщательно высушены перед использованием. ПЦР-каме-
И 3. Зак 577 7 3
ру (ламинарный шкаф) обработать УФ светом (экспозиция, как минимум, 15 минут, расстояние от УФ лампы 30 — 40 см).
3. Перед использованием весь инструментарий, ложки и емкости для взвешивания обработать 7 мМ NaOCl, стерильной дистиллированной водой и 96% этанолом. Тщательно высушить.
4. Для предотвращения контаминации обработать УФ светом микроцентрифужные пробирки (экспозиция 15 минут расстояние от УФ лампы 30-40 см), лизирующий буфер и ТЕ буфер в 50 мл конических пробирках (экспозиция — 30 минут, расстояние от УФ лампы — 30-40 см).
5. ВНИМАНИЕ: не добавлять протеиназу К в лизирующий буфер перед УФ облучением.
6. Во избежание контаминации концентраторы Centricon 100 должны собираться в ПЦР-камере или ламинаре.
7. Никакие реагенты, расходные или оборудование, используемые для экстракции, не должны вноситься и выноситься из зоны, где проводится работа с амплификонами.
8. Любое оборудование и инструментарий, которые вносятся в пре-амплификацион-ную зону из пост-амплификационной, должны стерилизоваться 7 мМ NaOCl перед выносом из пост-амплификационной зоны и затем в пре-амплификационной зоне перед использованием.
ВНИМАНИЕ: реагенты никогда не должны вноситься в пре-амплификационную зону из пост-амплификационной.
9. Резиновые перчатки следует менять перед каждой новой экстракцией.
10. В одно и тоже время обрабатывать только один образец.
Потери ДНК при выделении методом органической экстракции
В связи с тем, что в ядрах ДНК находится не в свободном состоянии, а в составе хроматина, выделение ДНК в чистом виде — довольно непростая задача. В настоящее время наиболее надежным методом получения препаратов ДНК является фенольно-детергентный метод, одним из существенных недостатков которого, однако, является значительная потеря ДНК на разных этапах экстракции.
Основным этапом фенольной экстракции является неоднократно повторяемая депротеини-зация образца. С этой целью белки вначале денатурируют и деполимеризуют (например, доде-цилсульфатом натрия и протеиназой К), а затем препарат несколько раз обрабатывают органическими неполярными растворителями — например, смесью фенол/хлороформ/изоами-ловый спирт. При этом денатурированные, де-полимеризованные белки, вследствие своей гид-
Уг 3*
75
рофобности, концентрируются, в основном, в нижней (неполярной) фазе (фенол/хлоро-форм/изоамиловый спирт) и в интерфазе; нуклеиновые кислоты остаются в верхней водной фазе. Следует учитывать, что pH раствора фенола существенно влияет на конечный выход ДНК.
Верхнюю фазу отбирают и повторяют с ней описанную процедуру еще несколько раз. Но при этом каждый раз теряется определенная доля ДНК — из-за того, что очень трудно собрать всю водную фазу целиком.
В практике работы отделения молекулярногенетических исследований 124 Центральной Лаборатории Медико-Криминалистической Идентификации Министерства Обороны Российской Федерации часто приходится работать с биологическим материалом, содержащим небольшие количества ДНК, что определяет важность прогноза возможных потерь препарата ДНК в процессе ее экстракции.
Ядерная ДНК клеток животных соединена с основными белками — гистонами, образуя так называемый хроматин. Этот комплекс содержит ДНК и гистоны в приблизительно равных количествах. Здесь, также помимо гистонов, присутствуют и разнообразные кислые белки, так что отношение всех белков к ДНК (по массе) в хроматине составляет приблизительно величину, равную 1,7. Эту величину мы используем в следующем примере.
Предположим, что в исходном препарате отношение белок/ДНК (по массе) равно 1,7, а в конечном препарате содержание белка не должно превышать 2%:
Потери же ДНК и белка при каждой депро-теинизации равны:
где за 100% принимается количество соответ-
ствующего вещества на момент очередной де-протеинизации.
Необходимо рассчитать требуемое количество депротеинизаций (п).
Конечные количества вещества в препарате связаны с начальными количествами следующим образом:
Используя заданные условия, получаем уравнение относительно п:
шБ° : Шд 0 — 1,7 ;
0,02.
Шд
сД= 12%, = 80%,
Щд1 - тд° (1- ?д)"; mg' - тБ° (1- Сб)п-
ШБ‘ ШБ° 1- Сб. п
0,02
х
или 0,02 ~ 1,7 х
Шд1 Шд° M-Qr
lg 1,7/0,02 n- -----------------= 3.
ig [(i-СлУ (i-Cb)]
To есть, необходимы три депротеинизации.
Итоговые же потери ДНК составят:
Слп=1-(1-Сд)3~0,32 =32%.
С учетом же других этапов очистки ДНК, эти потери становятся еще в 1,5-2 раза больше.
Эксперту также полезно уметь оценивать и количество ткани, требуемое для выделения определенного количества ДНК.
ПРИМЕР 1.
Для выполнения дальнейших расчетов, необходимо рассчитать массу ДНК, содержащейся в одной соматической клетке человека.
Предыдущая << 1 .. 11 12 13 14 15 16 < 17 > 18 19 20 21 22 23 .. 53 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed