Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Конки Д. -> "Культура животных клеток" -> 88

Культура животных клеток - Конки Д.

Конки Д., Эрба Э., Френши Р., Гриффитс Б. Культура животных клеток — М.: Мир, 1989. — 333 c.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка): kulturajivotnihkletok1989.djvu
Предыдущая << 1 .. 82 83 84 85 86 87 < 88 > 89 90 91 92 93 94 .. 136 >> Следующая

3. Техника часовых стекол
Эта техника была первоначально предложена Феллом и Робисоном [6] для изучения развития зачатков костей конечностей птиц. В дальнейшем использование этого метода распространилось на исследование роста и дифференцировки других тканей птиц и млекопитающих. При использовании этого метода ткани птиц помещают на сгусток, состоящий из равных частей плазмы кур и экстракта куриных эмбрионов и находящийся на часовом стекле. Одно или два таких стекла кладут в чашку Петри и закрывают сверху влажной ватой или фильтровальной бумагой (рис. 7.1) для предотвращения высыхания сгустка и эксплантатов. Чашки Петри переносят в термостат и культивируют обычно при 37,5 °С.
3.1. Получение эмбрионального экстракта
3.1.1. Материалы
Все реагенты и инструменты должны быть стерильными. Оплодотворенные куриные яйца, инкубированные 7—8 дней. Чашка Петри.
Прямые пинцеты.
Изогнутые пинцеты.
Изогнутые ножницы.
Слабо притертый стеклянный гомогенизатор Поттера — Элве-хейма с тефлоновым пестиком.
Эксплантат Сгусток плазмы
Рис. 7.1. Метод часовых стекол, разработанный Феллом и Робисоном, 19291
16].
Центрифужные пробирки, 50 мл (Corning).
Пастеровские пипетки.
Пипетки с широким кончиком, получаемые путем отламывания
носиков у обычных пипеток.
Сосуды для хранения.
Раствор Хэнкса.
70%-ный этанол.
3.1.2. Схема получения экстракта
I. Перед выделением эмбрионов протрите тупой конец яйца ваткой, смоченной 70%-ным этанолом, для стерилизации поверхности скорлупы. Осторожно удалите верхний конец скорлупы, разрушив ее легкими ударами и отшелушив скорлупу. Внутреннюю мембрану скорлупы прорвите прямым пинцетом. Извлеките эмбрион, взяв его за голову изогнутым пинцетом, и аккуратно перенесите в чашку Петри. Тщательно промойте эмбрион раствором Хэнкса, удалите глаза и вручную измельчите с помощью изогнутых ножниц.
II. Измельченную ткань перенесите в гомогенизатор пипеткой с отбитым кончиком и гомогенизируйте вручную в течение нескольких минут.
III. Смешайте полученный гомогенат с равным объемом раствора Хэнкса и центрифугируйте смесь при 20 g в течение
10 мин при 4 °С. Отберите супернатант и при необходимости центрифугируйте повторно для удаления суспендированных обломков клеток. Конечный супернатант опалесци-рует и не должен содержать клеток.
IV. Экстракт должен быть использован немедленно либо разлит во флаконы по 1 мл для хранения при —20 °С. Срок хранения не более 3 мес.
3.2. Получение куриной плазмы
Не рекомендуется использовать коммерческие препараты плазмы, поскольку они обычно не формируют плотного сгустка и не обеспечивают рост и дифференцировку тканей в такой степени, как свежеприготовленная плазма.
3.2.1. Материалы
Домашние куры в возрасте 6—12 мес.
Шприц на 30 мл с иглами.
Центрифужные пробирки.
Гепарин.
3.2.2. Схема подготовки ппазмы
I. Приготовьте плазму кур по стандартной методике, описанной Полом [24]. Для снижения содержания липидов в плазме не давайте птицам корма, по крайней мере 24 ч до получения крови.
II. Для предотвращения преждевременного свертывания плазмы используйте только силиконизированную посуду и промывайте шприц, которым вы собираете кровь, раствором гепарина (0,01—1%). Следует применять как можно более низкую концентрацию гепарина, чтобы не препятствовать образованию сгустка плазмы при ее смешивании с эмбриональным экстрактом.
III. Проверьте плазму на стерильность (см. гл. 4) и храните в силиконизированных пробирках при —20°С. Срок хранения не более 6 мес.
3.3. Получение эксплантатов
3.3.1. Материалы
Часовые стекла диаметром 3,5 мм.
Чашки Петри диаметром 91 мм.
Хлопковая вата или фильтровальная бумага для закрывания чашек Петри.
Стерильная дистиллированная вода или солевой раствор.
Градуированные пипетки на 10 мл.
Пастеровские пипетки.
Пипетки с широким кончиком, получаемые путем отламывания кончиков пастеровских пипеток.
Капиллярные пипетки, получаемые оттягиванием на пламени кончиков пастеровских пипеток.
Держатель пипеток (рис. 7.2).
Ж i
е
Рис. 7.2. Штатив из нержавеющей стали для пастеровских пипеток и хирургического инструмента.
Рис. 7.3. Хирургические инструменты: (а) прямой пинцет среднего размера; (б) прямые ножницы среднего размера; (в) часовой пинцет; (г) тонкие ножницы меньшего размера; (д) катарактный нож; (ж) анатомическая игла; (е) нож Сваин-Мортоиа.
Предметные стекла с лункой глубиной 6—7 мм. Стеклянные предметные стекла с площадью поверхности ~8 см2.
Экстракт куриных эмбрионов (50%).
Инактивированная нагреванием сыворотка (56°С в течение 30 мин); для клеток млекопитающих используются сыворотки крысы, лошади или теленка.
Стеклянные палочки для смешивания плазмы и экстракта.
Предыдущая << 1 .. 82 83 84 85 86 87 < 88 > 89 90 91 92 93 94 .. 136 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed