Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
Фелл и Робисон [6] предложили «технику часового стекла», согласно которой орган или часть органа выращивается во впадине часового стекла на поверхности сгустка, состоящего из плазмы цыпленка и эмбрионального экстракта кур. Это стало классической стандартной техникой морфогенетического анализа эмбриональных органов. Впоследствии метод был модифицирован для исследования действия гормонов, витаминов и канцерогенов на ткани взрослых млекопитающих [7], о чем более подробно сказано в гл. 3.
Другой тип культуральных сосудов представляет собой эмбриологическое часовое стекло, содержащее сгусток плазмы и покрытое стеклянной крышкой, приклеенной воском. Впервые такой сосуд был предложен Рудником [8] и позднее модифицирован Гэйлардом [9]. Гэйлард использовал сгусток, содержащий две части плазмы человека, одну часть плацентарной сыворотки человека, одну часть экстракта мозга ребенка и шесть частей солевого раствора.
Сгусток плазмы, способный поддерживать рост и развитие эмбриональных и взрослых органов, обладает тем не менее рядом недостатков. Обычно происходит его разжижение в окрестностях эксплантатов, так что последние оказываются в жидкости. Кроме того, из-за сложности среды оказывается невозможным проведение биохимических исследований.
2.2. Использование агара в качестве субстрата
Проблемы, возникающие 'при использовании сгустка плазмы, исчезают, если использовать сгусток агара. Техника культивирования на сгустке агара была предложена Спраттом [10, 11]. Вольф и Хаффен [12] модифицировали технику Гэйларда и
использовали для выращивания часовые стекла, содержащие агаровый гель. Агаровый метод успешно использовался в исследованиях по биологии развития и в морфогенетических исследованиях, и его детальное описание, как и описание метода выращивания на часовых стеклах, приведено в гл. 3. Поскольку агар не разжижается, он не может быть добавлен в культуру или взят для анализа без переноса культивируемого эксплантата. Для преодоления этого неудобства используются жидкие среды, в которых находятся подложки для предотвращения погружения эксплантатов.
2.3. Методы плотика
Чен [13] обнаружил, что бумага, используемая для протирания линз микроскопов, не смачивается и может плавать на поверхности жидкой среды. Он эксплантировал 4—5 культур на плотик из такой бумаги размером 25X25 мм, плавающий на поверхности жидкости в часовом стекле. Рихтер [14] улучшил эту методику, обрабатывая бумагу силиконом, что предотвращало ее погружение в среду. Лэш с сотрудниками [15] скомбинировали бумагу для протирания линз с миллипоровы-ми фильтрами. Они проделывали небольшое отверстие в центре плотика из бумаги и покрывали это отверстие полоской миллипорового фильтра. Это позволяло культивировать различные типы тканей на обеих сторонах фильтров и изучать взаимодействие этих тканей. Шеффер [16] заменил бумагу ацетатом вискозы. Всплывание полосок ацетата вискозы на поверхности жидкой среды достигалось обработкой силиконом четырех углов полосок. Преимущество ацетата вискозы перед линзовой бумагой заключается в том, что ацетат вискозы растворим в ацетоне и при подготовке ткани для гистологического анализа может быть растворен путем погружения в ацетон.
2.4. Метод сеток
Использование плотиков, плавающих на поверхности жидкой среды, не обеспечивает идеальных условий культивирования. Плотик часто тонет, и ткани оказываются погруженными в среду, причем на разную глубину. Эта проблема была решена >с помощью техники «сеток», предложенной Троувеллом [17]. Он предложил металлическую сетку, сплетаемую вначале из танталовой проволоки. В дальнейшем танталовая сетка была заменена более жестким, пригодным для прокатки металлом, например листами нержавеющей стали [18] или титана [19]. Сетка представляет собой квадрат с поверхностью 25X Х25 мм с отогнутыми краями, образующими четыре ножки высотой около 4 мм. Скелетные ткани можно культивировать
непосредственно на сетке, но более мяпкие ткани, такие как железы или кожа, должны быть вначале эксплантированы на полоски линзовой бумаги, а затем размещены на сетке. Сетка с эксплантатами помещается в культуральную камеру, заполненную средой KaiK раз до поверхности сетки. Первоначально техника Троувелла была предназначена для культивирования пканей взрослых млекопитающих, ‘которые характеризуются большей потребностью в кислороде по сравнению с эмбриональными. Для этого культуральные камеры заключали в контейнеры, которые затем продувались смесью СОг с кислородом. Метод успешно применялся для сохранения жизнеспособности и гистологической структуры взрослых тканей, таких как предстательная железа, почка, щитовидная железа и гипофиз. Этот метод, и особенно поддержание газовой фазы, в настоящее время значительно упростился и в модифицированной форме продолжает широко использоваться.
2.5. Чередование культивирования эксплантатов в среде и газовой фазе
Недавно для длительного культивирования взрослых тканей человека, таких как эпителий бронхов и молочной железы, пищевод и шейка матки [20—23], был успешно использован новый метод, обеспечивающий попеременное экспонирование ткани в среде и в газовой фазе. Для этого эксплантаты прикрепляются к дну пластикового культурального сосуда п покрываются средой. Сосуды затем помещают в камеру, заполняемую соответствующей газовой смесью. Камеру устанавливают на специальную платформу, которая в ходе культивирования качается с определенной -скоростью.
