Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
Этот метод используется для выявления клеток, обладающих специфическими мембранными антигенами. Клеши для этого обрабатываются моноклональными антителами, конъюгированными с флуоресцеином или родамином.
Реагенты
Конъюгированные с ФИТЦ антитела разводятся средой МЕМ с фосфатным буфером, содержащей 0,1% азида натрия и 2% телячьей сыворотки. Для определения оптимальной концентрации антител добавьте по 50 мкл различных раз-ведений антител к клеткам на микротитровальной пластинке. Анализируйте окрашивание с помощью флуоресцентной микроскопии. При использовании антител LEU-1 к клеткам человека разбавляйте их до концентрации 5 мкг/мл (0,25 мкг/50 мкл).
Клетки мыши и человека в концентрации 2 -107 клеток на лупку должны быть жизнеспособны не менее чем на 90%.
I. Внесите по 50 мкл клеток на лунку микротитровальной пластинки, содержащей в лунках по 50 мкл разведенной сыворотки, перемешайте.
II. Инкубируйте 50 мин на льду.
III. Центрифугируйте пластинку при 500 g.
IV. Отбросьте супернатант и дважды промойте осадки клеток МЕМ с буфером. Центрифугируйте клетки после каждой промывки при 500 g и отсасывайте супернатанты после промывки.
V. Для анализа методом проточной цитометрии ресуспендируйте клетки в холодной среде МЕМ до (концентрации ЫО6 клеток/мл; выдерживайте их на холоду до анализа [73, 74].
6. Обсуждение
В распоряжении исследователя, использующего проточную цитометрию, имеется большой выбор инструментов. Инструменты сходны, но не идентичны, поскольку каждый из них приспособлен для определенного типа экспериментов. Характеристиками приборов являются источники возбуждающего света, чувствительность фотоумножителей и компьютерная обработка.
Высокое разрешение всегда легко достигается при использовании когерентного света лазера с низкой интенсивностью и с узким пучком, фокусируемым на поток клеток.
Высокая чувствительность достигается только при использовании очень дорогих мощных лазеров, потребляющих значительное количество энергии (многоволновой аргоновый лазер с мощностью на выходе 18 Вт требует затраты энергии около 50 кВт/ч, а наиболее употребляемый 4-Вт аргоновый лазер потребляет более 22 ikBt/ч). Высокая мощность возбуждения требуется, например, если необходимо выявлять иммунофлуоресценцию небольшого числа мембранных рецепторов или когда флуорохромы требуют возбуждения в ультрафиолетовой области, где и аргоновые, и криптоновые лазеры обладают невысокой эффективностью. Кроме того, чем шире диапазон линий включенного в установку лазера, тем выше ее стоимость, а также потребление энергии. Следует учитывать, однако, что при использовании флуорохромов, аналогичных пропидийиоди-ду, анализ содержания нуклеиновых кислот в клетках позвоночных можно проводить с помощью относительно маломощного лазера (100 мВт), а исследования с использованием мит-рамицина и пропидийиодида требуют ртутной лампы с мощностью 100 Вт.
Сортировку клеток (сортинг) следует рассматривать отдельно от аналитического использования прибора. Для сортин-га необходимо использовать более сложную электронику. Следует учитывать, что при препаративной работе нельзя использовать прибор на пределе чувствительности и разрешения. Сортинг клеток обеспечивает получение в высокой степени однородных «леточных суспензий по выбранным параметрам. Все приведенные выше методы пригодны для сортинга. Следует отметить, что лишь немногие из них применимы к живым клеткам. Эта область требует дальнейшего развития. Другие ограничения метода сортинга носят технический характер: прежде всего, между каплями жидкости с клетками протекает по крайней мере 15 пустых капель с обволакивающим раствором. Это означает, что собираемые клетки сильно разбавляются и их последующее концентрирование сопровождается неизбежными потерями.
Увеличение скорости анализа сильно снижает чистоту получаемых препаратов, и паспортную скорость в 5000 клеток/с, предлагаемую поставляющими фирмами, следует рассматривать как максимальную, позволяющую получать препараты высокого качества. Более эффективное разделение достигается при скорости протока клеток не выше чем 2000 клеток/с. Эта скорость относится ко всем клеткам, проходящим через форсунку; реальный выход сортируемых «леток зависит от соотношения между сортируемыми клетками и клепками, которые отбрасываются, поскольку компьютер во время их прохождения занят обработкой информации, поступившей от предыдущих клеток. На практике низкая частота капель, содержащих клетки (1 капля с клеткой на 15 пустых капель), служит для решения именно этой проблемы, а также для снижения вероятности попадания двух клеток в одну каплю.
Время сортинга, необходимое для отбора достаточного количества клеток нужного типа, может быть весьма продолжительным. Это делает эксперименты менее эффективными, поскольку возрастает вероятность полной или частичной закупорки форсунки клеточными обломками, агрегатами или различными посторонними материалами. Изменения условий прохода клеток через форсунку оказывают наиболее серьезное влияние на потерю клеток и чистоту получаемых препаратов.
