Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
Зеленая флуоресценция — РНК (максимум флуоресценции выше 530 нм).
1. Добавьте 0,2 мл суспензии клеток (8-106 клеток/мл) в фосфатном буфере с 15% сыворотки к 0,4 мл раствора А и проинкубируйте 45—60 с при 4°С.
II. Добавьте 1,2 мл раствора красителя в растворе Б и проинкубируйте 2 мин при комнатной температуре.
III. Проведите анализ на проточном цитометре в течение 10 мин после добавления раствора Б.
Примечание.
Каждый этап этой процедуры важен для получения достоверных результатов. Особое внимание следует обратить на поддержание постоянного числа окрашиваемых клеток, поскольку результат зависит от соотношения нуклеиновых кислот и акридинового оранжевого, особенно ме-тахромазия РНК. Продолжительность экспонирования в окрашивающем растворе и его температура также сильно влияют на результаты реакции.
5.3. Применение процедур окрашивания
5.3.1. Дифференциальное окрашивание денатурированной и двунитевой ДНК
Реагенты
Сбалансированный солевой раствор Хэнкса с РНКазой А (1000 ед/мл).
0,2 М КС1, pH 1,35.
Акридиновый оранжевый; 5 мкг/мл (16,7 мкМ) в 0,1 М лимонной кислоте.
0.2 М Ыа2НР04-буфер, pH 2,6.
1. Суспендируйте 2-106 клеток в 1 мл раствора Хэнкса с РНКазой.
II. Инкубируйте при 37°С в течение 1 ч.
III. Смешайте 0,2 мл клеточной суспензии (4-105 клеток/мл)
(в растворе Хэнкса с РНКазой) с 0,5 мл 0,2 М КС1 pH
1,35 при 20 °С и инкубируйте 30 с.
IV. Добавьте к клеткам 2 мл раствора акридинового оранжевого и инкубируйте 2 мин.
V. Зеленая (530 нм) и красная (600 нм) флуоресценция отражает количество денатурированной и двухцепочечной
ДНК в клетках соответственно.
Примечание.
См. приложение к разд. 5.2.5.
5.3.2. Анализ клеточного цикла с помощью бромдезоксиуридинв (BrdU) и ирасителя Хёхст 33258
Краситель Хёхст 33258 флуоресцирует в диапазоне 410— 480 нм после возбуждения ультрафиолетом с длиной волны 315 нм. Он специфически связывается с парами оснований тп-мин — аденин и специфичен, следовательно, не только к ДНК, но и к присутствию тимидина. При анализе клеточного цикла инкубация клеток с БУДР приводит к замене тимидина в новообразованной ДНК на БУДР. Клетки, прошедшие S-фазу, остаются по содержанию тимидина такими же, как и диплоидные клетки; после деления они дают на гистограмме новый пик, соответствующий половинному содержанию тимидина в диплоидных клетках.
Этот метод позволяет проводить прямое измерение суммарного времени прохождения клетками фаз Gj и М [58—63].
Реагенты
Среда, содержащая БУДР (33 мкг/мл) и бромдезоксицитидин (26,4 мкг/мл) (эквимолярные концентрации).
Окрашивающий раствор: Хёхст 33258 в ФСБ.
Клетки пропускают через прибор примерно через 2 ч после окрашивания. По литературным данным окрашивание стабильно в течение 30 мин — 24 ч.
I Смешайте среду с БУДР с ростовой средой в соотношении 1 : 10.
II. Инкубируйте клетки в течение различных промежутков времени в соответствии с предполагаемой продолжительностью клеточного цикла.
III. После инкубации диссоциируйте клетки, как это делается для пересева
IV. Ресуспендируйте клетки непосредственно в растворе для окрашивания.
5.3.3. Окрашивание ДНК жизнеспособных клеток с помощью Хбхст 33342
Хёхст 33342 может быть использован для прижизненного окрашивания ДНК. Известно, что этот краситель обеспечивает достаточно высокое пропорциональное окрашивание ДНК, и клетки при этом сохраняют жизнеспособность. Возбуждение красителя проводится ультрафиолетом при 350—363 нм, а эмиссия флуоресценции регистрируется при длинах волн выше 450 нм [64—67].
Реагенты
0.25 М Хёхст 33342 в дистиллированной воде.
1. Клеточную суспензию (106 клеток/мл) окрасьте раствором краски Хёхст 33342 (5—10 мкм) при комнатной температуре в течение 20 мин.
II. Не промывайте клетки перед анализом.
5.3.4. Окрашивакие бепков ФИТЦ
Реагенты
70%-ный этанол.
Изотиоцианат флуоресцеина (ФИТЦ): 0,1 —1,0 мкг/мл растворяют в ФСБ, содержащем 40 мкг/мл РНКазы.
I. Фиксируйте «лепки в 70%-ном этаноле перед окрашиванием не менее 18 ч.
II. Центрифугируйте фиксированные клетки для удаления фиксатора.
III. Окрасьте клеточные белки раствором ФИТЦ в течение 30 мин при комнатной температуре.
IV. Анализируйте в проточном цитометре с аргоновым лазером при линии возбуждения. 488 нм и эмиссией флуоресценции в диапазоне 515—555 нм.
5.3.5. Двойное окрвшивание ДНК и белков
Для одновременного окрашивания фиксированные клетки обрабатывают раствором, содержащим пропидийиодид (18 мкг/мл в 0,1%-ном цитрате натрия), ФИТЦ (0,05 мкг/мл) и РНКазу (40 мкг/мл) в ФСБ при комнатной температуре не менее 20 мин (рис. 6.10).
Карцинома Льюиса легкого мыши
ФИТЦ (велки) О)
ФИТЦ (велки)
Рис. 6.10. Двойное окрашивание ДНК и белков. (Данные получены от Э. Эрба, Институт Марио Негри, Милан.)
5.4. Метод флуоресцентных антител с использованием флуоресцеина
Прямое иммунофлуоресцентное окрашивание клеточной поверхности
