Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
III. Установите скорость прохождения клеток через прибор 500 клеток/с.
5.2. Процедура окрашивания
5.2.1. Окрашиввние ядер и ДНК в суспензии пропидийиодмдом
Пропидийиодид является аналогом этидиумбромида; он ин-теркалирует в спирали нуклеиновых кислот, что сопровождается 20-кратным увеличением его флуоресценции. Интенсивность флуоресценции пропидийиодида в 1,8 раза превышает интенсивность флуоресценции этидиумбромида. При возбуждении светом с длиной волны 488 нм максимум эмиссии комплекса про-
пидийиодида с ДНК приходится примерно на 615 нм [21, 34— 42].
Типичная гистограмма представлена на рис. 6.8, где главный пик соответствует клеткам в фазе Gi, минорный пик—¦ клеткам в фазе Gг/М, а промежуток между ними заполнен клетками в S-фазе. Абсолютные значения могут быть получены путем использования стандартов, например эритроцитов кур, анализируемых одновременно с клетками образца.
Содержание ДНК в клетках мышиной легочной карциномы Льюиса (3LL)
Реагенты
Сбалансированный солевой раствор Хэнкса.
Окрашивающий раствор:
0,1%-ный цитрат натрия 100 мл.
Пропидийиодид 5 мг.
1%-ный Нонидет Р40 (водный раствор) 900 мкл.
I. Удалите опухоли у мышей линии C57BL/6 и промойте их фосфатным буфером в чашке Петри.
II. Удалите соединительную ткань и жир и измельчите ножницами.
III. Продавите маленькие кусочки ткани через иглу (1,20X Х38 мм) и ресуспендируйте в растворе Хэнкса при 4°С.
IV. Окрасьте суспензию клеток 3LL добавлением 3 мл раствора пропидийиодида ж 200—300 мкл суспензии в концентрации 500 000 клеток/мл.
V. Перед определением флуоресценции выдержите клетки при 4°С в течение 20—30 мин.
VI. Измеряйте эмиссию флуоресценции между 580 и 750 нм для исключения перекрытия с областями возбуждающего света и флуоресценции несвязавшегося пропидийиодида.
5.2.2. Применение к культивируемым клеткам
Реагенты. Те же, что в разд. 5.2.1.
I. Удалите среду из культуральной посуды и дважды сполосните клетки раствором Хэнкса.
II. Добавьте 5 мл раствора пропидийиодида и оставьте на 10 мин при 4°С.
III. Отделите ядра путем многократного пипётирования и проанализируйте проточной цитометрией.
5.2.3. Окрашивание пропидийиодидом ДНК в цвпых кпетквх
Реагенты 70%-ный этанол.
Пропидийиодид (50 мкг/мл), содержащий 40 мкг/мл РНКазы.
I. Зафиксируйте клетки в 70%-ном этаноле (см. разд. 4.1.3).
II. После центрифугирования слейте спирт и окрасьте порции клеток (1-10®—ЫО6 клеток/мл) пропидийиодидом в течение 30 мин при комнатной температуре.
5.2.4. Окрашивание ДНК митрамицином и пропидийиодидом
В комбинированном методе окрашивания, использующем флуоресцентный антибиотик митрамицин и пропидийиодид, происходит перенос энергии с донорных молекул митрамицина на акцепторные молекулы пропидийиодида.
Этот метод используется для окраски и анализа образцов солидных опухолей, клеток спермы и гинекологического материала, а также клеток культуры ткани [43].
Реагенты
Митрамицин (10 мкг/мл).
Пропидийиодид (10 мкг/мл).
Хлористый магний (15 мМ).
0.1%-ный Нонидет Р40.
Трис-НС1 pH 7,5.
1. Суспензия .клеток должна быть использована сразу после получения или не позднее, чем через неделю после
Фиксации 70%-ным этанолом.
красьте раствором пропидийиодид/митрамицин при 4°С в течение часа.
III. После окрашивания пропустите клетки через проточный цитометр, возбуждаемый ртутной лампой (100 Вт) с запирающим фильтром BG12 (3 мм) и одиночным фильтром К590.
5.2.5. Окрашивание ДНК и РНК акридиновым оранжеаым
Для дифференциальной идентификации ДНК и РНК используют метахроматические свойства акридинового оранжевого. Акридиновый оранжевый — это флуоресцентный краситель нуклеиновых кислот в фиксированных и нефиксированных клетках, маркер лизосом. Его можно использовать также для наблюдения изменения метахромазии флуоресценции в мертвых клетках или для дифференциации клеток в фазе Go и клеток, проходящих клеточный цикл.
Несмотря на технические трудности в получении воспроизводимых измерений ДНК и РНК, этот метод чрезвычайно широко используется некоторыми группами исследователей [44—57].
Дифференциальное окрашивание ДНК и РНК.
Реагенты
Раствор А: стабилен в течение 2 нед, должен храниться на холоду.
0,1%-ный тритон Х-100 0,1 мл.
IN НС1 8 мл.
1 М NaCl 15 мл.
Дистиллированная вода 76 мл.
Общий объем 100 мл, pH 1,5.
Раствор Б: стабилен несколько месяцев.
0,01 М ЭДТА 10 мл.
1 М NaCl 15,5 мл.
0,4 М Na2HP04 31,5 мл.
0,2 М лимонная кислота 18,5 мл.
Дистиллированная вода 24 мл.
Общий объем 99 мл, pH 6,0.
Исходный раствор акридинового оранжевого 1 мг/мл в дистиллированной воде.
Примечание. Акридиновый оранжевый обладает канцерогенной активностью, обращаться с осторожностью.
Рабочий раствор акридинового оранжевого
0.1 мл исходного раствора смешать с 9,9 мл раствора Б. Примечание. Система омывающей жидкости прибора должна храниться при 4°С.
Аргоновый лазер; линия возбуждения 488 нм.
Красная флуоресценция — ДНК (максимум флуоресценции выше 600 нм).
