Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
Механическая дезагрегация
Мягкие ткани, содержащие небольшое количество фиброзной ткани, могут быть иногда переведены в суспензию одиночных клеток путем механической дезагрегации, хотя число полученных этим методом живых клеток всегда меньше, чем после использования других методов. Другой недостаток механической дезагрегации заключается в том, что высвобож-
дающиеся из ткани клетки остаются в кластерах, а не в виде одиночных клеток. Механичеокая дезагрегация клеток достигается продавливанием фрагментов тканей через серию сит с постепенно уменьшающимся размером ячеек (250, 100 и
20 мкм) или через иглы шприца со снижающимся размером (например, 18, 21 и 23G) [2; 21; 22].
Трудно рекомендовать какой-либо один метод для дезагрегации солидной ткани (особенно солидных опухолей). Для одной ткани подходит один метод; при этом клетки оказываются неповрежденными. Этот же метод может быть совершенно непригоден для другой ткани. При начале работы с новой тканью придерживайтесь схемы, приведенной ниже; дальнейшее же развитие исследований должно основываться на опыте и на анализе литературы.
Реагенты и материалы (стерильные)
Ножницы или пара скальпелей.
Магнитная мешалка.
Сита из нейлона или нержавеющей стали с размером ячеек 100 и 20 мкм.
Сбалансированный солевой раствор Хэнкса.
Растворы ферментов: 0,25%-ный трипсин в ФСБ; 1 мМ ЭДТА в ФСБ; 0,1%-ная проназа (Sigma) в ФСБ или полной культуральной среде; ДНКаза (100 мкг/мл, конечная концентрация 1—5 мкг/мл) (Sigma Worthington). Коллагеназа градации CLS (Worthington) или градации 1 (Sigma); исходный раствор 2000 ед./мл, конечная концентрация 100—1000 ед./мл.
I. Поместите ткань в раствор Хэнкса при 4°С. Разрежьте ткань на фрагменты размером 1 мм3 с помощью ножниц или перекрестных движений скальпелей и дважды промойте раствором Хэнкса.
II. Слейте раствор Хэнкса и замените его раствором ферментов для дезагрегации в соотношении 10—15 мл на 1 г ткани.
III. В конце ферментативного переваривания остановите действие ферментов путем переноса в лед или добавления сыворотки и клетки, отделенные от фрагментов ткани, центрифугируйте 10 мин при 1200 об/мин. Фильтрация через сита с уменьшающимися размерами ячеек (100 н 20 мкм) позволит освободиться от клеточных агрегатов и крупных клеточных обломков.
Примечание.
Если вы собираетесь определять содержание ДНК в клетках, не добавляйте к препаратам ДНКазу. В других случаях можно добавлять ДНКазу (1—5 мкг/мл) для того, чтобы свести к минимуму реагрегацию, обусловленную высвобождением ДНК из лизированных клеток.
4.1.3. Фиксация суспензии клеток
Клеточная суспензия может быть использована как в виде живых интактных клеток, так и в фиксированном состоянии. Фиксированные клеши используются для дальнейшего окрашивания и последующего анализа проточной цитометрией. Наиболее часто используется фиксация этанолом.
Реагенты и материалы
Сбалансированный солевой раствор Хэнкса или ФСБ, свободные от Са2+ и Mg2+, и содержащие 1 мМ ЭДТА.
Этанол 95%-ный.
I. Суспендируйте клетки в холодном растворе Хэнкса без Са++ и Mg++, содержащем 0,5 мМ ЭДТА до концентрации IX Ю6 клеток/мл.
II. Поддерживая температуру суспензии 4°С, добавляйте по каплям 95%-ный этанол при постоянном перемешивании до достижения соотношения 3 объема этанола на 1 объем клеточной суспензии, так чтобы конечная концентрация этанола составляла 70%.
III. Выдержите 'клетки в суспензии в течение нескольких минут.
IV. Перед цитофотометрией «летки должны быть освобождены от этанола центрифугированием и ресуспендированы в фосфатном буфере или другом реагенте.
5. Примеры типов исследований
5.1. Светорассеяние неокрашенных клеток
Присутствие в световом пучке каких-либо частиц, например клеток, нарушает однородность пучка и приводит к перераспределению падающего света. Характер реэмиссии энергии клетками оказывается сложным, и дифракция, преломление и отражение света взаимодействуют между собой в зависимости от объема «леток, их поверхностной конфигурации и внутренних структур. Имеющиеся в продаже установки обычно измеряют светорассеяние в двух фиксированных положениях: малоугловое прямое рассеяние под углом около 10° и рассеяние под углом 90°.
Рассеяние под углом 90° обусловлено главным образом дифракцией и определяется внутренними структурами клеток. Малоугловое прямое рассеяние рассматривается как наиболее представительное выражение клеточного объема [22—23]
(рис. 6.9).
Измерение рассеяния Реагенты и материалы
Сбалансированный солевой раствор Хэнкса.
I. Суспендируйте клеши в растворе Хэнкса до концентрации 1 • 105 — 1 • 106 клеток/мл.
II. Заполните резервуар прибора, содержащий обволакивающую жидкость, раствором Хэнкса.
Рис. 6.9. Светорассеяние неокрашенных клеток (Ortho Instruments 410 University Avenue, Westwood MA02090). Дифференциальный подсчет нейтрофилов (Н), эозинофилов (Э), лимфоцитов (J1) и моноцитов (М) в кровн человека нефлуоресцентным методом.
