Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
4.5. Идентификация и количественная оценка иммунологических продуктов
Принимая во внимание широкое использование гибридомнон технологии, никакой обзор свойств клеточных линий не будет полным, если в нем не будет упомянута эта область исследований. Наиболее надежным критерием идентификации является, естественно, специфичность моноклональных антител, продуцируемых гибридомой. Если этот клеточный продукт отсутствует и его синтез не может быть восстановлен, то линия гибридомных клеток ценности не представляет. Однако потенциальное количество различных гибридом, теоретически равное числу существующих эпитопов, намного превышает число имеющихся различных линий слившихся клеток. Это создает проблему для любого учреждения, создающего банк гибридом, поскольку ни одна индивидуальная организация не в состоянии идентифицировать все моноклональные антитела даже в современной ситуации, когда количество антител относительно невелико.
В связи с этим можно рассмотреть компромиссное решение, принятое АТСС. Представительство банка гибридом может определить класс, подкласс и количество секретируемых гибридомой иммуноглобулинов и провести оценку других стандартных признаков линии клеток (см. рис. 4.1). Кроме того, может быть установлена картина ИЭФ продуцируемых молекул иммуноглобулина. Этой информации может оказаться достаточно для выявления перекрестного загрязнения.
4.5.1. Применение теста Охтерлони для обнаружения изотипов иммуноглобулинов
Метод Охтерлони для определения изотипов иммуноглобулинов, продуцируемых гибридомами, является относительно простым. В табл. 4.13 приведена процедура приготовления агаровых пластинок.
I. Получите образцы от каждой испытываемой культуры гибридом, приближающейся к максимальной клеточной плотности, и соберите супернатант после центрифугирования (200 g, 10 мин).
II. Поместите по 35 мкл супернатанта во внешние лунки. В случае низкого титра антител в культуральной среде
Таблица 4.13. Получение пластинок для теста Охтерлони
1. Агарозу и азид натрия растворите в ФБ до концентрации 0,8 и 0,25% соответственно путем нагревания в кипящей водяной бане
2. Добавьте 10 капель 0,5%-ного водного раствора трипанового синего к 250 мл раствора и осторожно перемешайте
3. Перенесите по 1,5—2 мл горячего раствора в чашки Петри размером 60X15 мм для создания тонкого слоя на дне чашек. Во время затвердевания этого слоя сосуд с оставшимся раствором агарозы держите в водяной бане при 56 °С
4. После затвердения первичного слоя добавьте примерно по 4 мл раствора агарозы в каждую чашку и дайте образоваться вторичному слою
5. Сделайте лунки в центре и по периферии агаровой пластинки, используя трубчатое сверло для пробок. Отсосите из лунок вторичный верхний слой, используя пипетку, соединенную с любым вакуумным устройством
6. До использования храните пластинки в холодильнике
может возникнуть необходимость повторного внесения супернатанта в ту же лунку вплоть до 4 раз.
III. Поместите 35 мкл специфической типирующей аитисы-воротки к мышиным иммуноглобулинам в центральную лунку.
IV. Инкубируйте пластинки при комнатной температуре во влажной атмосфере в течение ночи и на следующий день просмотрите их. Между лункой с супернатантом положительной гибридомы и центральной лункой со специфическими антителами к известному иммуноглобулину должна образоваться линия преципитации. Типичный пример приведен на рис. 4.9.
Рис. 4.9. Тест на изотип антител по методу Охтерлонн. Полоса преципитации между центральной и какой-либо периферической лунками характеризует положительный ответ.
4.5.2. Определение количества секретируемого иммуноглобулина методом радиальной иммунодиффузии
После того как идентифицирован изотип, можно определить количество иммуноглобулина, продуцируемого гибридомой. Соответствующую типирующую антисыворотку смешайте с агаром (табл. 4.14). Добавьте концентрированный раствор супернатанта гибридомы в лунку для антигена в агаровом слое. По мере диффузии антигена из лунки в агар вокруг лунки образуется кольцо преципитата антиген-антитело. Измерьте диаметр кольца и по стандартной кривой определите количество внесенного в лунку антигена. После получения агаровых пластинок присту-
Таблица 4.14. Приготовление диффузионных пластинок
Буфер
Агаровая основа
Смесь антисыворотки с агаром
Растворите 0,5 г К2НРО4 и 0,6 г NaCl в 100 мл би-дистиллированной воды и доведите pH до 8,0 Добавьте 1,5 г агара Noble к 50 мл буфера и растворите в кипящей водяной бане. Храните в холодильнике порциями по 5—10 мл Разведите типирующую антимышиную антисыворотку кролика в буфере pH 8,0 (1 : 10) и нагрейте раствор до 56 °С в водяной бане. Агаровую основу растворите в кипящей водяной бане и охладите до 56 °С
После уравновешивания температур смешайте равные объемы двух растворов, перенесите немедленно на предметное стекло и дайте затвердеть
пайте к определению количества иммуноглобулина согласно
следующей схеме.
I. Соберите 25 мл бесклеточного супернатанта исследуемой культуры гибридомы, выросшей до плотности, близкой к максимальной, и охладите до 4°С.
