Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
3%-иая Нг02 (0,1 мл)
Трис-буфер (10 мл)
‘) Наборы, предназначенные для этого метода [36]. выпускаются фирмой DAKO Со., Santa Barbara. СА.
мого флуоресцентного окрашивания. Кроме того, можно выявить специфические белки цитоскелета иммуноцитохимически, как это показано ниже для кератина. Реагенты (табл. 4.12) и наборы для окрашивания белков цитоскелета поставляются многими фирмами.
Выявление кератина в клетках монослойной культуры на покровном стекле или в клетках, осажденных центрифугированием на предметное стекло, проводится следующим образом.
I. Зафиксируйте клетки 20 мин в метаноле, содержащем 3%-ную Н2О2, и быстро (в течение 30 с) промойте в проточной водопроводной воде.
II. Поместите препараты в буфер для промывки на 5 мин, извлеките и отсосите жидкость. На этой и всех последующих стадиях следует тщательно избегать подсушивания препаратов.
III. Монослой клеток или «пятно» клеток, осажденных на предметное стекло, покройте нормальной забуференной сывороткой (табл. 4.12) и оставьте на 30 мин при комнатной температуре.
IV. Отсосите сыворотку, добавьте разбавленную кроличью антисыворотку к кератину и оставьте на 30 мин при комнатной температуре.
V. Отсосите сыворотку и осторожно промойте несколько раз буфером. Поместите препараты в бюксы с буфером для промывки и оставьте на 15 мин.
VI. Отсосите жидкость, покройте препараты свиной антисывороткой к кроличьим IgG и оставьте на 30 мин.
VII. Промойте несколько раз буфером для промывки, поместите на 15 мин в бюкс со свежим буфером для промывки п тщательно отсосите жидкость.
VIII. Покройте клетки забуференным реагентом ПАП (см. табл. 4.12), проинкубируйте 30 мин при комнатной температуре, промойте несколько раз буфером для промывки и оставьте в бюксе со свежим буфером на 15 мин.
IX. Отсосите жидкость, покройте клетки свежеприготовленным раствором хромогена и оставьте на 5 мин.
X. Осторожно промойте бидистиллированной водой, окрасьтс гематоксилином, обезводьте и заключите в Парамаунт.
Указанием на положительную реакцию служит локальное отложение продукта реакции — темно-коричневого преципитата. Отрицательные контроли, ставящиеся параллельно с исследуемыми образцами, представляют собой препараты клеток на стеклах, обработанные на этапе IV буфером для промывки вместо антикератиновой антисыворотки. В качестве положительного контроля можно использовать линии клеток карцином, такие как SCC4 или SCC15, или даже срезы кожи. Более подробно с этим методом можно ознакомиться в работах [35 и 36].
4.4.3. Выявление ткакаспацифических антигенов
Вопросам выделения и изучения свойств ткане- и опухолеспецифических антигенов посвящено немало исследований. Методы этих исследований различны в разных лабораториях и зависят также от типа линий клеток и тканей. Ниже приведено лишь несколько примеров, дающих представление о перспективах этих исследований.
Линия опухолевых клеток легкого человека 2563 (полученная из опухоли МАС-21) была использована Акесоном [37] непосредственно в качестве антигена для кроликов. При анализе полученной антисыворотки с помощью реакции связывания комплемента, иммунофлуоресцентного теста и метода насыщающего связывания в ней обнаружили антитела, специфические для антигенов нормальной ткани почек. Эти антитела могли быть избирательно адсорбированы препаратами легочной ткани; следовательно, существует антиген, общий для этих двух нормальных органов.
Сериани с сотрудниками предоставили данные, показывающие наличие специфических антигенов молочной железы в нормальных и опухолевых клетках молочной железы. Эти исследователи иммунизировали кроликов обезжиренным препаратом верхней фракции отстоенного молока человека. Видоспецифические антитела удалялись из этой сыворотки путем адсорбции на эритроциты человека. Результаты непрямого иммунофлуоресцентного анализа показали, что антитела, содержащиеся в такой антисыворотке, специфически связываются с линиями клеток нормальной молочной железы и карциномы молочной железы человека. Был предложен чувствительный метод радиоиммуноанализа, позволивший получить количественное подтверждение этих результатов. Семь линий карциномы молочной железы и первичные культуры эпителия молочной железы связывали по крайней мере в 10—30 раз больше антител, чем фиброблас-ты молочной железы и эпителиальные клетки из других источников. Трипсинизация клеток MCF-7 и МДА-МВ-157 приводила к снижению реактивности клеток на 80—84%, что указывало на поверхностную локализацию антигенов, специфических для молочной железы [38].
Чу с сотрудниками разработали методы выделения, очистки и количественного определения антигена предстательной железы. Этот> антиген выделяли из семенной жидкости или ткани предстательной железы человека. Грубые экстракты тканей обрабатывали сульфатом аммония и преципитируемый материал растворяли, диализовали и далее очищали путем колоночной хроматографии (ДЭАЭ и сефадекс). Фракции с мол. массой 26—37 кД, содержащие антиген предстательной железы, кон-
центрировали ультрафильтрацией, и полученный препарат использовали для иммунизации кроликов [39].
