Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
2. Забуференная четырехокись осмия 1%: концентрированный буфер
и 4%-ный раствор четырехокиси осмия смешиваются в соотношении 3 : 1
3. Смола для заливки.
Тщательно смешать перед использованием 7 частей смеси Б с 3 частями смеси А и добавить катализаторы до концентрации 1,5-2%
¦) Реактивы могут быть получены от фирмы Polysciences, Inc. Warrington, РА.
V. Дополнительно фиксируйте материал 1%-ной четырех-окисью осмия в течение 1 ч.
VI. Слейте фиксатор и трижды промойте фиксированный материал БВ. Продолжительность каждой промывки не менее 5 мин.
VII. Оставьте материал на 16—20 ч в 0,5%)-ном растворе ура-нилацетата. Низкий pH раствора приводит к удалению гликогена, но способствует прекрасному сохранению и прокрашиванию мембран.
VIII. Проведите материал через серию спиртов (10—30—70— 95—100—100%-ные), выдерживая клетки в каждом растворе не менее 10 мин. При проводке осажденных клеток после спирта необходимо последовательно, в течение 10 мин, пропитать фрагменты клеточного конгломерата смесью 100%-ного спирта со 100%-ным пропиленоксидом (1:1), 100%-ным пропиленоксидом и смесью 100%-ного пропи-леноксида со смолой для заливки (1:1). При проводке монослоя клеток на пластиковой поверхности последние три этапа можно опустить. В этом случае монослой клеток пропитывается 100%) ным спиртом в течение 30 мин и затем смесью 100%-ного спирта со смолой для заливки (1:1).
IX. Слейте последний раствор для проведения и начните пропитку материала 100%-ной смолой для заливки (смесь растворов Б и А в соотношении 7:3 и 1,5—2% ДМР 30, см. табл. 4.11), Оптимальным способом пропитки является внесение фрагментов с диаметром не менее 1 мм в специальные капсулы для заливки (ВЕЕМ, фирма *Polyscien-ces), заполненные смолой. Препараты вносятся в верхнюю часть капсул и в течение нескольких часов опускаются на дно капсул.
При подготовке монослоя смола для заливки наливается в культуральный флакон и клетки пропитываются в течение 8—18 ч.
Для удаления пузырьков воздуха капсулы ВЕЕМ с заключенным материалом или открытые культуральные сосуды поместите под вакуум.
X. Проведите полимеризацию при 65—70 °С в течение 24 ч или более продолжительного времени до достижения необходимой твердости. Предложенное соотношение смеси Б/А обеспечивает достаточно высокую твердость и может быть модифицировано в соответствии с опытом и целью исследователя [33].
XI. В случае монослоя вырежьте предназначенный для исследования участок пропитанных клеток с помощью тонкой алмазной пилки и приклейте его на временную пластиковую подставку. Лучше всего использовать быстро сохнущий контактный клей. Образцы могут быть затем ориентированы для получения поперечных срезов или для отбора срезов, тангенциальных к поверхности монослоя (например, при изучении десмосом). В случае осадка клеток срежьте кончик капсулы, заточите его в случае необходимости бритвой с одной режущей кромкой и установите в держателе микротома.
XII. Срезы для электронно-микроскопического анализа получайте с помощью ультрамикротома (см. инструкции фирм-
изготовителей). Для получения увеличения в 15 000 раз и выше используйте серебристые и серые срезы. При меньшем увеличении можно использовать золотистые срезы.
XIII. Разместите срезы на подходящей сетке, окрасьте в течение 20—60 с цитратом свинца, исследуйте в электронном микроскопе и в случае необходимости сфотографируйте. Для более подробной информации следует обратиться к работам [33 и 34].
4.4.2. Иммунологические тесты ка белки цитоскелета
Цитоплазматические промежуточные филаменты, которые образуют весьма существенную часть цитоскелета, оказались чрезвычайно удобными для идентификации клеток. На основе морфологии, полипептидного состава и уникальной иммуноген-ности можно различать по крайней мере 5 подгрупп филамен-тов. Было показано, что распределение этих подгрупп филамен-тов оказывается тканеспецифичным. Так, эпителий большинства органов содержит цитокератин (или цитокератины), а клетки мезенхимной ткани — виментин. Десмин присутствует в мио-генных клетках, белок нейрофиламентов — в нейронах, а кислый белок фибрилл глии — в клетках глии [35].
Обнаружение филаментов может быть произведено с помощью электронной микроскопии или путем прямого или непря-
Таблица 4.12. Реагенты для иммуноцитохимического выявления кератина
1. Фиксатор
2. Трис-буфер
3. Нормальная сыворотка
4. Кроличья антикератнновая антисыворотка
5. Свиная антисыворотка к кроличьим IgG
6. Растворимые комплексы перокси-дазы хрена с кроличьей аитисы-вороткой к пероксидазе (ПАП)
7. Буфер для промывки
8. Хромогеи
Готовить’ непосредственно перед
использованием
3%-иая Н202 (50 мл)
Безводный метаиол (250 мл) Смешивать непосредственно перед использованием
0,1 М, pH 7,6; использовать для реагентов 3—6 и 8
10%-ная свниая сыворотка в трпс-буфере
От 1 : 20 до 1 : 100 в трис-буфере 1 : 20 в трис-буфере 1 : 100 в трис-буфере
1 часть трис-буфера (0,5 М, pH 7,6) 9 частей 0,9% NaC! 3,3-Диамииобензидиитетрагидрохло-рид (6 мг)
