Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
Сыворотка кролика является наиболее подходящим источником комплемента для этой реакции, благодаря присутствию в ней природных антител к клеткам человека. Взаимодействие этих антител с другими антигенами клеточной поверхности усиливает комплемент-зависимое цитотоксическое действие комплекса антител к ЛАЧ с антигенами. Титры и специфичность этих природных антител могут варьировать даже среди смешанных препаратов сыворотки кролика. Возникающие проблемы можно преодолеть, изменяя продолжительность инкубации, используя различные источники и разведения комплемента, разводя кроличью сыворотку сывороткой человека, или же путем абсорбции кроличьей сыворотки культивируемыми клетками [27]. Может потребоваться раздельный анализ каждой линии клеток, поскольку конечный результат зависит от множественных взаимодействий между присутствующими антителами и спектром антигенов на поверхности каждого типа клеток.
Присутствие определенных аллоантигенов ЛАЧ на поверхности исследуемой линии клеток может быть подтверждено тестом на подавление абсорбции. Для этого способность клеток абсорбировать аллоантитела к ЛАЧ из антисыворотки с известной специфичностью определяется по степени потери цитотоксиче-ского эффекта после абсорбции. Оценка потери цитотоксичности проводится путем параллельного титрования антисыворотки до и после абсорбции панелями линий лимфоцитарных клеток с известными профилями ЛАЧ [27].
4.3.3. Дифференциальное окрашивание хромосом (G-сегментироваиие]
Надежным методом идентификации клеток, в ряде случаев близким к абсолютному, является хромосомный анализ после обработки трипсином и окраски по Гимза (выявление G-полос). Выявляемые этим методом особенности окраски сегментов хромосом являются характерными для каждой пары хромосом и позволяют опытному цитогенетику обнаруживать даже минорные инверсии, делеции и транслокации. Многие линии сохраняют множественные маркерные хромосомы, которые легко идентифицируются этим методом и могут служить специфическими положительными маркерами клеток.
Известны различные модификации исходного метода окраски на G-полосы [28]. Следующая модификация может быть применена к анализу препаратов распластанных метафазных
пластинок, получаемых согласно методике разд. 4.1.3 (этап X).
I. Используйте высушенные на воздухе препараты в течение 2—7 сут после получения.
II. Инкубируйте препараты в 0,025 М фосфатном буфере (ФБ;
3,4 г КН2РО4 в 1 л воды, pH 6,8) при 60 °С в течение 10 мин. Используйте ФБ во всех последующих операциях.
III. Непосредственно перед использованием приготовьте красящий раствор, содержащий 6,5 мл ФБ, 0,55 мл раствора трипсина (1%-ный раствор трипсина Дифко, разведенный в 250 раз дистиллированной водой), 2,5 мл 100%-ного метанола и 0,22 мл раствора Гимза (коммерческий препарат). 1%-ный исходный раствор трипсина может быть заготовлен заранее и храниться при —70 °С.
IV. Залейте каждый препарат 1 мл красящего раствора и оставьте на 15 мин.
V. Быстро ополосните дистиллированной водой и высушите на воздухе.
Полностью высушенные препараты используются для микроскопического анализа без покровных стекол с планапохромат-ным объективом с масляной иммерсией. Иммерсионное масло наносится непосредственно на предметное стекло. Следует соблюдать осторожность, чтобы не повредить клетки. Сразу после анализа следует как можно тщательнее удалить все иммерсионное масло. Обычно бывает достаточно нескольких промывок стекол в ксилоле. Типичный препарат хромосом, окрашенных на G-полосы, приведен на рис. 4.8.
Более полное описание метода и дополнительные примеры получения препаратов приведены в работах [29 и 30].
4.3.4. Другие методы
В настоящее время появились новые методы, обеспечивающие надежную идентификацию клеток, особенно клеток животных одного вида. Эти методы здесь не рассматриваются подробно, и желающие могут обратиться к работам [31 и 32].
Один из этих методов включает в себя двуме^ый электрофорез с высоким разрешением и подробно рассмотрен в обзоре Андерсона и сотрудников [31]. В основу метода положено разделение клеточных белков по двум независимым параметрам: молекулярной массе и изоэлектрической точке. Аналитическими методами, используемыми для проведения этих разделений, являются изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) в присутствии мочевины и электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия. Каждый из этих методов позволяет разделить более 100 белков. При комбинации этих методов в условиях двумерного разделения можно теоретически разделить 10 000 белков, но на
« —* A
'Ч'Г
Рис. 4.8. Дифференциально окрашенные (на G-полосы) хромосомы клеток линии АТСС НТВ 16 (U-138MG), выделенных из глиобластомы человека (Фотография любезно предоставлена Т. Р. Чен.)
практике за один анализ разделяются около 2000 белков. Не все клеточные белки выявляются в стандартном геле, поскольку некоторые кислые и основные белки уходят за его пределы. Была разработана техника неравновесного градиента, позволяющая дополнительно выявить 1000 или 2000 белков из некоторых типов клеток.
