Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
4.3.2. Тесты на ентигены групп крови и антигены гистосовместимости
Антигены групп крови и лейкоцитарные антигены человека (ЛАЧ) на плазматических мембранах клеток человека в культуре могут служить дополнительными и часто используемыми маркерами для идентификации клеток. Отсутствие экспрессии или частичная экспрессия этих антигенов были достоверно показаны во многих случаях.
Антигены групп крови присутствуют на поверхности нормальных эпителиальных клеток человека в первичной культуре и на поверхности некоторых постоянных линий эпителиальных клеток. Обычный тест на эти антигены заключается в следующем.
I. Получите суспензию клеток путем диссоциации клеток монослоя или отбора части суспензионной культуры. Промойте клетки ФСБ стандартным центрифугированием и ресуспендированием.
II. Подсчитайте число клеток и доведите их концентрацию до 1-2- 106/мл.
III. Поместите 4 отдельные капли суспензии на большое предметное стекло и добавьте к трем каплям по капле антисыворотки групп крови человека А, В или АВ. К четвертой капле, служащей отрицательным контролем, добавьте каплю ФСБ.
IV. Немедленно смешайте компоненты каждой капли с помощью разных стеклянных палочек и наблюдайте при малом увеличении наличие агглютинации. В отрицательном контроле также может происходить некоторое слипание клеток, но эта агрегация оказывается ничтожной по сравнению с таковой в смеси суспензии, содержащей антиген клеток с антисывороткой.
Опыт предложившей этот тест лаборатории показывает, что антиген группы крови донора может экспрессироваться даже в линиях опухолевых клеток [8, 9]. Часто случается, однако, что другие линии клеток человека, полученные от доноров с группами крови А, В или АВ, не взаимодействуют с антисыворотками, давая ложноотрицательные результаты, относящие клетки к группе крови 0. Можно полагать, что это вызвано исчезновением антигенов с клеточной поверхности в ходе диссоциации клеток; это можно проверить, повторив тест после 2—18 ч культивирования клеток в суспензионной культуре. Однако, несмотря на .то что такая инкубация должна была бы восполнить антигены группы крови на клеточной поверхности, клетки, дававшие ложноотрицательный ответ, оставались отрицательными по экспрессии антигенов групп крови.
Эта проблема с выявлением антигенов групп крови на поверхности культивируемых эпителиальных клеток ждет своего
решения. Тем не менее при первичном скрининге межвидового загрязнения линий клеток этот простой тест в сочетании с другими тестами обладает значительной информативностью.
В работах [8J и [9] приведены результаты использования этого теста при анализе различных линий клеток.
Главная система гистосовместимости у человека состоит из антигенов ЛАЧ, расположенных на плазматических мембранах большинства ядерных клеток. Эти многочисленные антигены, кодируемые кодоминантными генами (77 аллелей) пяти тесно сцепленных локусов в 6-й хромосоме, представляют собой наиболее полиморфную из известных систем у человека. Антигены выявляют с помощью стандартного двухэтапного цитотоксиче-ского теста, зависящего от комплемента; для оценки жизнеспособности используется тест на исключение красителя (разд.
3.3.1).
Ниже приведено упрощенное стандартное описание проведения теста.
I. Антитела из выбранной панели внесите в лунки пластиковой пластинки для типирования гистосовместимости по 1 мкл на лунку, используя шприц Гамильтон. Коммерческие препараты антисывороток получают обычно от доноров, иммунизированных ЛАЧ при беременности, или в результате переливания крови. Пластинки для типирования, загруженные спектром антисыворотки к ЛАЧ, могут быть также предназначены для рутинных клинических исследований. Для каждой клеточной линии и для каждого проведения анализа должны иметься отрицательные контроли.
II. Получите суспензию клеток и промойте их, как и в тесте на антигены крупп крови, используя среду RPMI 1640
без сыворотки. Доведите концентрацию клеток до 108/мл и добавьте по 1 мкл суспензии в каждую лупку, используя шприц Гамильтон.
III. Смешайте содержимое лунок, установив пластинку на шейкер, и инкубируйте 30 мин при 20 °С.
IV. Добавьте в каждую лунку по 5 мкл кроличьего комплемента и инкубируйте 60 мин при 20 °С.
V. Добавьте в каждую лунку по 3 мкл 5%-ного водного раствора эозина и дайте окраситься погибшим клеткам в течение 2 мин.
VI. Заполните лунки забуференным формалином (pH 7,2) и
накройте покровными стеклами (50X75 мм) для вырав-
нивания поверхности жидкости.
VII. С помощью инвертированного микроскопа найдите окрашенные клетки. Как правило, достаточно лишь приблизительно оценить долю окрашенных клеток, а не производить точногб подсчета.
Этот метод может быть с успехом применен для типирова-ния ряда линий клеток, хотя в некоторых случаях может потребоваться модификация предложенной процедуры. Главным фактором, определяющим вариабельность процедуры, является присутствие неспецифических антител в препаратах кроличьего комплемента и в антисыворотке к ЛАЧ.
