Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Конки Д. -> "Культура животных клеток" -> 57

Культура животных клеток - Конки Д.

Конки Д., Эрба Э., Френши Р., Гриффитс Б. Культура животных клеток — М.: Мир, 1989. — 333 c.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка): kulturajivotnihkletok1989.djvu
Предыдущая << 1 .. 51 52 53 54 55 56 < 57 > 58 59 60 61 62 63 .. 136 >> Следующая

Следует подчеркнуть, что предложенный скрининг может не выявить латентные вирусы и вирусы, не вызывающие общий ЦПЭ и не индуцирующие гемадсорбцию. В работах [17, 18] более подробно изложены методы выявления вирусного заражения, а также приведены дополнительные специализированные тесты для обнаружения вирусов, заражающих клетки.
4.3. Тесты на заражение клеточных культур клетками другого вида
По мере увеличения количества используемых клеточных линий пропорционально возрастает и риск загрязнения этих линий клетками других линий. Проблема становится особенно острой в лабораториях, в которых проводятся интенсивные исследования со многими различными линиями клеток человека (гибридомами), доступными к настоящему времени. Тесты на полиморфные изоферменты, маркерные поверхностные антиге-
ны, а также кариологический анализ являются важными инструментами в обнаружении клеточных перекрестных загрязнений внутри данного вида.
4.3.1. Изоэнзимология
В разд. 4.1.2 был приведен метод подтверждения видовой принадлежности линии клеток по электрофоретической подвижности изоферментов ГФД, ЛДГ и НФ. Сходная методика может быть также использована для скрининга межвидовых заражений.
В линиях клеток от различных особей одного и того же вида часто встречаются различные ко-доминантные аллели данного ферментативного локуса, продукты которого полиморфны и разделяются электрофоретически. В большинстве случаев фенотип этих аллельных изозимов (аллоферментов) чрезвычайно стабилен. В соответствии с этим если определить фенотипы аллоферментов для достаточного числа локусов, то они могут стать генетической аллоферментной «визитной карточкой» для каждой изучаемой специфической линии клеток [19—24].
При работе с линиями клеток человека определение фенотипов аллоферментов семи или более ферментов, таких как аде-нозиндезаминаза (АДА), ГФД, эстераза D (ЭС-D), пептидаза D (ПЕП-D), фосфоглюкомутазы 1 и 3 (ФГМь ФГМ3) и 6-фос-фоглюконатдегидрогеназа (ФГД), оказывается достаточным для весьма надежной идентификации клеток [20]. Методология анализа приведена в разд. 4.1.2, а в табл. 4.9 приведены прописи соответствующих красителей.
Примеры зимограмм для шести таких аллоферментов из линий клеток человека приведены на рис. 4.7. В случае АДА для простоты приведены только эритроцитарные формы. В клетках человека из некоторых других тканей обнаруживаются дополнительные АДА. Они могут представлять собой вторичные формы изоферментов АДА, образующиеся из изозимов АДА эрит-роцитарного типа путем посттрансляционной модификации. Более того, экспрессия изоферментов АДА может зависеть также и от условий культивирования [23].
Аллоферменты ФГМ3 относятся к наиболее быстромигрирующим формам этой группы. Эти аллоферменты обладают низкой активностью и в соответствии с этим требуют более длительной окраски. Аллоферменты ФГМ] мигрируют медленно, обладают высокой активностью и быстро окрашиваются. Алло-ферменты лучше всего выявляются на ранних стадиях до более полного выявления ФГМ2 и ФГМ3.
Частота встречаемости генетической структуры для каждой отдельной линии клеток может быть оценена по наблюдаемому фенотипу аллоферментов и результатам оценки частоты )
Таблица 4.9. Процедуры1* для выявления АДА, ЭС-D, ПЕП-D, двух видов ФГМ н ФГД
Фермент Буфер Буфер Раствор красителя
в камере в геле
АДА тц тц (0,1 х) 0,1 М Na3P04 pH 7,0 (20 мл)
Н20 (30 мл)
Аденозин (50 мг)
10 мг МТДТ
ФМС (3 мг)
Нуклеозидфосфорилаза (1 мг/мл)
(50 мкл)
ПЕП-D ТЭБ ТЭБ (0,!Х) Ксантииоксидаза (10 мг/мл)
(50 мкл)
Н2О (40 мл)
0,1 М NaH2PO* pH 7,4 (10 мл)
Ь-Фенилаланил-Ь-пролин (20 мг)
Пероксидаза хреиа (тип 2) (10 мг)
Оксидаза аминокислот (1 мг/мл)
(50 мкл)
О-Дианзидии (2 мг)
0,1 М МпСЬ (0,2 мл) (добавлять
непосредственно перед смешиванием
с наносимым на гель раствором)
ЭС-D ТЦ ТЦ (0,1Х) 0,05 М ацетат натрия pH 5,2,
(50 мл)
Метилумбеллифернлацетат, раство
ренный в 2 мл ацетона (10 мг)
ФГМ) и ТЦ ТЦ (0,1Х) Н20 (35 мл)
ФГМз 0,5 М трис pH 8,0 (15 мл)
Предыдущая << 1 .. 51 52 53 54 55 56 < 57 > 58 59 60 61 62 63 .. 136 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed