Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Конки Д. -> "Культура животных клеток" -> 56

Культура животных клеток - Конки Д.

Конки Д., Эрба Э., Френши Р., Гриффитс Б. Культура животных клеток — М.: Мир, 1989. — 333 c.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка): kulturajivotnihkletok1989.djvu
Предыдущая << 1 .. 50 51 52 53 54 55 < 56 > 57 58 59 60 61 62 .. 136 >> Следующая

II. Используя лампу для просвечивания яиц, найдите участок с наиболее выраженным развитием кровеносных сосудов зародыша и аккуратно просверлите скорлупу в центре этого участка, не повреждая ее оболочки.
III. Нанесите 2—3 капли раствора Хэнкса на боковое отверстие и осторожно продавите этот раствор через оболочку скорлупы, используя иглу от шприца с калибром 26. Раствор Хэнкса должен просочиться и распространиться над хорионаллантоисной мембраной (ХМ) для облегчения ее отделения от оболочки.
IV. Прижмите короткую резиновую трубку к отверстию на тупом конце яйца и слегка отсосите ртом воздух. С помощью лампы для просвечивания яиц следите за образованием искусственного воздушного мешка над ХМ.
V. Заклейте оба отверстия квадратиками липкой ленты и проинкубируйте яйца при 37 °С в горизонтальном положении. Для инкубации яиц можно пользоваться стандартными термостатами для клеточных культур и термостатированными комнатами. Термостаты с высокой влажностью или с продувкой смеси воздуха с С02 для этой цели не подходят.
Яйца с развивающимся зародышем и с искусственным воздушным мешком готовы для проверки клеток на вирусное за-
ражение через 24—48 ч. Очень важно перед инъекцией клеток проверить все яйьа и отбросить те из них, в которых обнаружатся признаки гибели или дегенерации. Присутствие интакт-ных кровеносных сосудов и движения зародыша могут, как правило, служить указанием на хорошее состояние яиц. В этом случае следует приступить к следующим процедурам:
I. Приготовьте суспензию проверяемых клеток в подходящей культуральной среде в концентрации 2,5—5-107 клеток/мл. Опухолевые клетки заморозьте в смеси сухого льда со спиртом и разморозьте в водяной бане при 37 °С. Эту операцию проведите 2 раза.
II. Удалите наклейку с бокового отверстия яйца и введите по
0,2 мл суспензии или гомогената клеток на ХМ каждого из 5—10 яиц.
III. Через сутки после инокуляции клеток просмотрите все яйца с помощью просвечивающей лампы и отбросьте яйца с погибшими зародышами. Периодически повторяйте осмотр в течение 8—9 сут.
IV. Если эмбрион сохранил жизнеспособность к концу периода инкубации, вскройте яйцо над искусственным воздушным мешком и тщательно обследуйте ХМ для выявления отеков, участков изменения морфологии и оспинок. Обследуйте также и сами зародыши для выявления таких аномалий, как искривление тела или задержка роста.
V. В случаях, указывающих на наличие вирусного заражения, повторите тест, используя как повторные образцы подозреваемых клеток, так и свежие порции жидкости из яиц, в которых зародыш погиб либо развился неправильно.
Положительные контроли могут быть получены путем инъекции в яйца вируса гриппа, вируса болезни скота Ньюкастла и/или вируса саркомы Рауса. Для отрицательного контроля в яйца вводится только стандартная среда для культуры клеток. В работе [17] приведены схемы и более детальное описание введения материала в яйца.
Другим удобным методом обнаружения вирусного загрязнения является совместное культивирование испытуемых клеток и линий клеток, служащих и хорошими хозяевами для предполагаемых вирусов. Этот метод особенно удобен для суспензионных культур. Выбор индикаторной линии или линии клеток-мишеней зависит от вида, к которому принадлежит испытываемая линия клеток. Так, например, при проверке линий клеток человека можно использовать для совместного культивирования клетки W1-38, клетки MRC-5 или первичную культуру эмбриональных клеток почки человека. В данном случае в качестве индикаторной линии можно использовать клетки другого вида, например африканской зеленой мартышки.
После выбора подходящей линии индикаторных клеток предлагается следующая методика проведения совместного культивирования.
I. Посейте во флаконы Т-75 по 106 клеток каждой линии в общем объеме 8 мл соответствующей ростовой среды. В ряде случаев концентрации клеток могут варьировать для поддержант обеих клеточных популяций в ходе совместного культивирования. Так, например, при совместном культивировании очень быстро пролиферирующих индикаторных клеток с испытуемыми, размножающимися медленнее, начальное число первых и последних при посеве может быть доведено до соотношения 1 : 10. С другой стороны, медленно размножающаяся популяция может быть повторно посеяна во флакон со смешанной культурой клеток в случае преимущественного зарастания культуры клетками, делящимися быстрее.
II. Меняйте культуральную среду дважды в неделю и проводите пересев клеток, как обычно, через некоторое время после достижения полного монослоя. При анализе линий, растущих в суспензии, собирайте клетки центрифугированием и продолжайте их культивирование после обычного разбавления.
III. Периодически проверяйте культуры на ЦПЭ и проводите тест на гемадсорбцию. Эти испытания проводите не реже чем каждые 2—3 нед, в соответствии с изложенными выше методиками.
Присутствие вируса может быть обнаружено методами стандартной нейтрализации (подавление гемадсорбции, бляшкооб-разования, гемагглютинации) 'in‘jo с помощью реакции связывания комплемента.
Предыдущая << 1 .. 50 51 52 53 54 55 < 56 > 57 58 59 60 61 62 .. 136 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed