Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Конки Д. -> "Культура животных клеток" -> 55

Культура животных клеток - Конки Д.

Конки Д., Эрба Э., Френши Р., Гриффитс Б. Культура животных клеток — М.: Мир, 1989. — 333 c.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка): kulturajivotnihkletok1989.djvu
Предыдущая << 1 .. 49 50 51 52 53 54 < 55 > 56 57 58 59 60 61 .. 136 >> Следующая

Все работы по качественному выявлению микоплазмы в неизвестных культурах следует проводить в вертикальных ламинарных боксах, по возможности освобожденных от работы с другими культурами. Нужно постоянно помнить о возможности зара-
Рис. 4.6. Микрофотография ДНК микоплазмы (стрелки), окрашенной красителем Хехст. Более крупные флуоресцирующие тела — это ядра клеток Ve-
го, использованных в качестве индикаторных. (Фотография любезно предоставлена М. Л. Мэси).
жения чистых культур аэрозолями от зараженных микоплазмой культур при работе с ними в одном и том же боксе или через руки исследователя в ходе работы с многочисленными культуральными сосудами. В связи с этим рекомендуется дезинфекция бокса или рабочего места.
Более подробная информация о работе с микоплазмой приведена в руководствах [5, 6 и 16].
4.2.3. Тесты на присутствие вирусов
Среди различных тестов, применяемых для выявления посторонних агентов, ассоциированных с клетками, наиболее трудными являются тесты на эндогенные и экзогенные вирусы. Развитие характерного цитопатогенного эффекта (ЦПЭ), со всей очевидностью, может служить ранним указанием на присутствие вируса. Однако отсутствие ЦПЭ пе может служить доказательством отсутствия вируса в культуре. Действительно, латентная инфекция может существовать в линиях клеток, не проявляя себя, пока не будут применены подходящие иммунологические, цитологические, ультраструктурные и/или биохимические тесты. Для активации и выделения вируса могут потребоваться дополнительные системы хозяев или специфическая обработка (например, галогенизированными нуклеозидами).
С самого начала следует подчеркнуть, что представленные ниже прописи следует рассматривать как средства быстрого выявления наиболее часто встречающихся вирусных заражений клеточных линий. В эти прописи помимо рутинного анализа на ЦПЭ в фазово-контрастном микроскопе включены инъекции в яйца и некоторые тесты на совместное культивирование и гем-адсорбцию. Аналогичные общие тесты рекомендуются правительственными службами в случае использования линий клеток— продуцентов биологического продукта.
Для морфологического выявления вирусов в культуре.
I. Расположите каждый флакон или сосуд таким образом, чтобы свет проходил через монослой, и попытайтесь обнаружить бляшки, фокусы или участки нарушения однородности монослоя. При посеве культур из банка замороженных клеток следует объединять содержимое не менее 5% ампул из каждого набора клеток.
II. С помощью инвертированного микроскопа и используя по возможности фазово-контрастную оптику, обследуйте каждый культуральный сосуд, обращая особое внимание на наличие измененных участков, описанных выше, отличающихся по морфологии от окружающих клеток.
III. При необходимости проведения дополнительных исследований или для анализа при большем увеличении приготовьте культуры на покровных стеклах. Покровные стекла с полученными монослойными культурами следует фиксировать и окрашивать с помощью стандартных гистологических методов, а морфологию исследуемых клеток следует сравнивать с соответствующими контролями.
Присутствие некоторых вирусов, не вызывающих ЦПЭ в культивируемых клетках, может быть установлено с помощью теста на гемадсорбцию. Зараженные клетки адсорбируют индикаторные эритроциты при кратковременной инкубации на холоду. Для проведения этого теста следует:
I. Получить культуры исследуемых клеток во флаконах Т-25, используя такую плотность посева, чтобы клетки достигали монослоя в течение 48—72 ч культивирования. При анализе культур из банка замороженных клеток следует объединять для посева не менее 5% ампул из каждой партии клеток.
II. Слить среду с клеток и ополоснуть их 5 мл раствора Хэйкса без двухвалентных катионов.
III. Добавить к клеткам по 0,5 мл 0,5%-ной свежеприготовленной суспензии эритроцитов кур, морских свинок и человека (группа крови 0) (эритроциты трижды промыть'физиологическим раствором). Флаконы с клетками и эритроцитами инкубировать при 4 °С в течение 20 мин.
IV. Провести макроскопический и микроскопический (при небольшом увеличении) анализы агрегации эритроцитов и их адсорбции на монослое.
V. Прежде чем сделать вывод об отсутствии гемадсорбции, следует повторить тест со всеми культурами, на которых были получены отрицательные результаты.
В качестве удобного положительного контроля можно использовать культуру клеток RhMK, зараженных 0,2 мл неразве-денного препарата вируса гриппа за 48—72 ч до проведения теста.
Инъецирование проверяемых клеток или их гомогенатов в куриные яйца с развивающимся зародышем является дополнительным чувствительным тестом на присутствие вирусов. Подготовку яиц для этого теста следует производить следующим образом:
I. Просверлите небольшое отверстие в скорлупе над воздушным мешком (тупой конец) у 8—9-суточных куриных эмбрионов, используя электродрель и сверло диаметром 1,6 мм. При этой и всех последующих операциях следует использовать простерилизованные инструменты. Перед и после каждой манипуляции протирайте поверхность скорлупы, где проводится сверление, тампоном, смоченным 70%-ным спиртом. Сверла перед использованием также должны быть помещены в 70%-ный этанол.
Предыдущая << 1 .. 49 50 51 52 53 54 < 55 > 56 57 58 59 60 61 .. 136 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed