Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Конки Д. -> "Культура животных клеток" -> 54

Культура животных клеток - Конки Д.

Конки Д., Эрба Э., Френши Р., Гриффитс Б. Культура животных клеток — М.: Мир, 1989. — 333 c.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка): kulturajivotnihkletok1989.djvu
Предыдущая << 1 .. 48 49 50 51 52 53 < 54 > 55 56 57 58 59 60 .. 136 >> Следующая

V. В течение последующих 14 сут переносите по 0,1 мл бульона на свежую агаровую пластинку с недельным интерва-
лом и инкубируйте при 37 °С в анаэробных условиях.
VI. Используя инвертированный микроскоп, обследуйте все агаровые пластинки (увеличение 100Х иЗООХ) еженедельно, в течение как минимум 3 нед. На рис. 4.5 представлена микрофотография колоний микоплазмы на агаре.
Поскольку некоторые штаммы микоплазмы, особенно М.hy-
orhinis, трудно или невозможно выращивать в искусственной
Таблица 4.8. Растворы для непрямого флуорохромиого выявления
микоплазмы
Концентрированный раствор флуорохрома (ЮООх)
Краситель Хехст 33258 5 мг
Тимерсаль (мертиолат) 10 мг
Добавьте в 100 мл раствора Хэнкса без бикарбоната натрия н фенолового красного и тщательно перемешайте в течение 30 мин при комнатной температуре.
Храните при 4 °С в темной посуде, тщательно обернутой алюминиевой
фольгой. Краситель чувствителен к свету и теплу.
Рабочий исходный раствор флуорохрома (1—5Х)
Готовится путем добавления 0,1—0,5 мл концентрированного раствора
(Ю00Х) в 100 мл раствора Хэнкса без бикарбоната и фенолового красного
н перемешивается, как и при приготовлении раствора (Ю00Х)-
Среда для заключения
Лимонная кислота (0,1 М) 22,2 мл
Na2HP04 (0,2 М) 27,8 мл
Глицерин 50 мл
Хранить при 4 °С и проверять pH перед использованием. Оптимальный pH для флуоресценции составляет 5,5.
Фиксатор
Ледяная уксусная кислота 1 часть
Безводный метанол 3 части
среде, в программу контроля должен быть также включен непрямой метод исследования. Непрямое обнаружение микоплазмы проводится в следующей последовательности.
I. В чашки Петри (60 мм), содержащие покровные стекла (№ 1) размером 10,5X22 мм, внесите 105 индикаторных клеток в 4 мл МЕМ с 10% эмбриональной телячей сыворотки. Обычно используются клетки Vero или клетки ЗТ6. Эти клетки помогают усиливать низкий уровень инфекции, которая в противном случае может остаться незамеченной.
II. После инкубации этих индикаторных культур в течение 16—24 ч при 37 °С в атмосфере 95% воздуха и 5% СОг добавьте 0,5 мл исследуемых клеток, готовя суспензию так же, как и в прямом испытании.
III. Вновь поместите чашки в термостат на 6 сут.
IV. Извлеките культуральные чашки из термостата, слейте среду и немедленно добавьте фиксатор. Важно не дать культуре высохнуть перед добавлением фиксатора, поскольку это может привести к артефактам.
V. Через 5 мин замените «использованный» фиксатор на свежий так, чтобы стекла с клетками все время оставались погруженными в раствор.
VI. Отсосите фиксатор, высушите препараты на воздухе и приготовьте свежий рабочий раствор из 1000-кратного концентрата.
VII. Добавьте по 5 мл окрашивающего раствора в каждую чашку, закройте и оставьте на 30 мин при комнатной температуре.
VIII. Отсосите краситель и промойте культуру тремя сменами дистиллированной воды (по 3—5 мл). После последней промывки тщательно отсосите воду и дайте препаратам высохнуть.
IX. Смонтируйте покровные стекла на предметных стеклах (1X3 см) клетками вверх, используя каплю среды для заключения.
X. Добавьте вторую каплю среды для заключения на поверхность смонтированного препарата и покройте покровным стеклом большего размера, соблюдая стандартную технику заключения для избежания захвата пузырьков.
XI. Исследуйте препараты в флуоресцентном микроскопе при увеличении 500Х, используя возбуждающий фильтр BG12 (330/380 нм) и запирающий фильтр № 50 (LP440 нм). Примечание. Клетки, достигшие монослоя, недостаточно
распластаны и окрашиваются Хехстом 33258 не очень хорошо. Следите, чтобы для окраски использовались культуры клеток, не достигшие полного монослоя.
В каждую серию испытаний необходимо включать положительные и отрицательные контроли. Отрицательным контролем для этого непрямого испытания могут служить клетки Vero или ЗТ6, инкубируемые только со средой. Положительными контро-лями могут служить М. liyorhinis, М. arginini, М. orale и A. laid-lawii, причем если есть возможность выбора, то следует использовать штаммы, приведенные в начале списка. Нуклеиновые кислоты микроорганизмов выявляются в виде точечного или фибриллярного материала, рассеянного по цитоплазме и сконцентрированного в ядрах культивируемых клеток (рис. 4.6). При тяжелых инфекциях прокрашивается также и внеклеточное пространство.
Получение положительных контролей, то есть искусственное заражение культур, создает опасность для других линий клеток, так что заражение культур по срокам и месту проведения должно быть отделено от работы с другими линиями клеток. Положительные контроли следует фиксировать и хранить при •—4 °С в эксикаторе вплоть до проведения анализа.
Предыдущая << 1 .. 48 49 50 51 52 53 < 54 > 55 56 57 58 59 60 .. 136 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed