Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
4.2.2. Обнаружение микоппазмы
Заражение культуры клеток микоплазмой создает значительно более сложные проблемы, чем заражение бактериями и грибами. Присутствие некоторых видов микоплазмы в культуре может быть обнаружено по вызываемым ими дегенеративным эффектам. Однако другие виды микоплазмы могут активно метаболизировать и пролиферировать в культуре, не вызывая каких-либо заметных морфологических изменений в линии клеток, которую они загрязняют. При этом, если в задачу исследователя входит изучение метаболизма клеток, свойств поверхностных рецепторов, взаимодействия вирусов с хозяином и тому подобное, присутствие микоплазмы в культуре может приводить к неточной или вовсе неправильной интерпретации результатов. В настоящее время существует 9 основных методов выявления микоплазмы [5, 6], из которых в АТСС постоянно применяются прямые культуральные испытания и непрямые исследования с использованием бисбензимидазольного флуорохрома (Хехст 33258) для окраски ДНК- Контролю на микоплазму подвергаются все приходящие в коллекцию линии клеток, а также все клетки, предназначенные для распределения [16].
Сыворотка, дрожжевой экстракт и другие компоненты, используемые для выделения и размножения микоплазмы, должны быть предварительно проверены на отсутствие токсичности и на активность, индуцирующую рост [5]. В качестве положи-
Таблица 4.7. Состав сред, используемых для культуральных испытаний на присутствие микоплазмы
А. Основная среда
Компонент Концентра Компонент Концентра
ция, г/л ция, г/ л
D-Глюкоза 50 D-Пентотенат кальция 0,024
Ь-Аргинин-НС1 10 Пирндоксаль-НС! 0,020
ДНК тимуса 0,02 Фолиевая кислота 0,010
Холинхлорид 0,922 Цианокобаламин 0,003
i-Инозит 0,110 D-Бнотин 0,002
Ниацинамид 0,024 Тиамин-НС1 0,010
Растворить в бидистиллированной воде, довести объем до 1 л, стерилизовать фильтрованием, довести в случае необходимости pH до 7,2—7,4; хранить порциями по 100 мл при —70 °С
Б. Бульон для микоплазмы
Компонент Инструкция
Сухой бульон (Beclon Dickinson) 14,7 г В 600 мл БВ и автоклавиро-
вать
Феноловый красный 0,02 г
Лошадиная сыворотка 200 мл Стерильно смешать с бульо
ном при комнатной темпе-
25%-ный дрожжевой экстракт 100 мл Хранить при ---20 °С в алик
вотах по 100 мл 25%-ного
раствора. Конечная концент
рация 2,5%
Основная среда А 100 мл
Довести при необходимости pH до 7,2—7,4, разлить порции по 10 мл в стерильные пробирки, хранить при 4°С н использовать в течение 4 нед
В. Среда с агаром для мнкоилазмы
Компонент Инструкция
Сухой агар 23,7 г В 600 мл БВ и авто-
клавировать. Охладить
до 50 °С в водяной
бане
Лошадиная сыворотка 200 мл Нагреть до 37 °С и сте
рильно смешать с рас
плавленным агаром
25%-ный дрожжевой экстракт 100 мл
Основная среда А 100 мл
Быстро перенести порции по 10 мл в чашки Петри диаметром 60 мм и хранить в закрытом контейнере при 4 °С. Использовать в течение 4 нед
тельных контролей используются штаммы M.arginini, M.orale и A.laidlawii, поскольку они относятся к видам, наиболее часто выделяемым из культивируемых клеток [6, 16].
I. При проверке культуры следует быть уверенным в том, что культуральная среда не содержит антибиотиков, особенно гентамицина, тилоцина и других ингибиторов микоплазмы.
II. Из культуры, достигшей стадии полного или плотного монослоя и не получавшей питательных добавок в течение по крайней мере 3 сут, удалите всю среду, за исключением 3 мл, раббером соскребите часть клеток. Из суспен-
Рис. 4.5. Микрофотография колонии микоплазмы на агаровой пластинке.
Мелкие частицы между колониями — это обломки клеток из клеточной суспензии.
зионных культур, приближающихся к стационарной фазе, пробы можно отбирать непосредственно.
III. Перенесите 1 мл клеточной суспензии в пробирку с бульоном для микоплазмы и 0,1 мл суспензии на пластинку с агаром для микоплазмы.
IV. Инкубируйте бульон в анаэробных условиях при 37 °С,
а пластинки агара при той же температуре во влажной
газовой смеси 95% N2 и 5% СОг. Изменение pH бульона или его помутнение будет свидетельствовать о наличии микоплазмы.
