Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
4.2. Тесты на микробное заражение
Приведенных ниже тестов достаточно для выявления большинства микроорганизмов, которые могут выживать в качестве примесей в линиях клеток и в культуральной среде. Методы выявления простейших здесь не представлены, поскольку эти организмы редко встречаются в перевиваемых линиях клеток. Описание этих методик можно найти в другом руководстве [13].
Коммерческая сухая среда наиболее пригодна для выявления бактерий грибов и микоплазмы при условии, что каждая партия среды заранее проверяется на загрязнение.
4.2.1. Обнаружение бактерий и грибов
Рекомендуется следующий порядок исследования клеточных культур и подозреваемой культуральной среды на загрязнение бактериями и грибами:
I. Проведите индивидуальное исследование культуральных сосудов с помощью инвертированного микроскопа, по возможности с фазово-контрастной оптикой. Проверка должна быть особенно тщательной, когда предполагается культивирование большого количества клеток. Первоначально каждая культура просматривается при малом увеличении.
II. В асептических условиях отберите порции проверяемых культур и оставьте культуры в изолированных условиях для дальнейшего анализа. В случае обнаружения микроб-
ных загрязнений проавтоклавируйте культуры и уничтожьте их.
III. Приготовьте влажное предметное стекло, используя капли исследуемой жидкости, и просмотрите в микроскопе при большом увеличении.
IV. Приготовьте мазки, зафиксируйте их нагреванием и окрасьте каким-либо стандартным методом (например,.
Таблица 4.6. Предлагаемые режимы для обнаружения бактериальных и грибковых загрязнений в культурах клеток1)
Иснытательная среда Температу Снабжение Продолжи
ра, “С кислородом тельность
наблюдения,
сут
Кровяной агар со свежей дефибри- 37 Аэробное 14
нированной кровью кролика (5%) 37 Анаэробное
Тиогликолатный бульон 37 Аэробное 14
26
Триптиказный соевый бульон 37 Аэробное 14
26
Бульон с экстрактами мозга и серд 37 Аэробное 14
ца 26
Бульон Саборада 37 Аэробное 21
26
Бульон YM 37 Аэробное 21
26
Питательный бульон с 2%-ным 37 Аэробное 21
дрожжевым экстрактом 26
’) Более подробно см. руководство [151.
красителем Райта). Проанализируйте препараты под микроскопом с масляной иммерсией.
V. Сопоставьте полученные результаты с микрофотографиями руководств [14 и 15], в которых детально представлены наиболее распространенные микробные загрязнения.
Микроскопическое обследование пригодно лишь для обнаружения сильных загрязнений, но даже и они не всегда выявляются при простом микроскопическом анализе. Поэтому, чтобы убедиться, что хранящиеся клетки и среда не содержат грибов и бактерий, следует провести серию культуральных испытаний. Испытание запасов замороженных клеток рекомендуется проводить следующим образом.
I. Соберите и смешайте содержимое примерно 5% всех ампул данной партии, используя шприц с иглой калибра 20. Как правило, рекомендуется не добавлять антибиотики в среду, предназначенную для культивирования и сохранения популяции клеток запаса. Если же в среде были антибиотики, то размороженную суспензию следует центри-
фугировать при 2000 g в течение 20 мин и полученный осадок ресуспендировать в среде без антибиотиков. Серия таких переосаждений в среде без антибиотиков снизит концентрацию антибиотиков, присутствие которых в ряде случаев может мешать выявлению заражений.
II. Отобранный материал посейте на каждую из испытательных сред, представленных в табл. 4.6 (как минимум по
0,3 мл клеточной суспензии), и инкубируйте в соответствии с указанными в таблице условиями. Включите в проверку положительные и отрицательные контроли, содержащие достаточный диапазон бактерий и грибов, которые ожидается обнаружить. Рекомендуемая для испытания группа микроорганизмов включает в себя Pseudomonas aeruginosa, Micrococcus salivarius, Escherichia coli, Bacteroides distasonis, Penicillium notatum, Aspergillus niger и Candida albicans.
III. Выращивание проводите в течение 14—21 сут, как указано в табл. 4.6, прежде чем убедитесь, что результаты испытания отрицательны. На наличие загрязнений указывает образование колоний на твердой среде или помутнение жидкой среды в соответствующих условиях выращивания.
