Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
культуру. Снабжение кислородом культур с микроносителями может осуществляться благодаря следующим системам:
а) Поверхностная аэрация.
б) Увеличение скорости перфузии полностью оксигенированной среды из резервуара.
Таблица 3.4. Сравнение объемов среды и общих объемов для разных систем моиослойиых культур
Площадь поверхности (см!)
Общая На см3 На см3
среды культуры
Флакон Ру 175---200 2 0,2
Вращающиеся бутыли 750---1500 4 0,3
--- Плеики 8500 5 5
--- Стеклянные трубки 5000---340 000 2 42)
--- Пластины 6300---17 000 6---10 3---5
Мультипластинчатый блок 6000---24 000 2,5 0,5
Полые волокна 1000---5000 (30) (25)2>
Оптицелл 42 500---180 000 40 352>
Пластиковые мешки ЗОО1' 5 5
Пластиковые трубки 25 000 25 20
Реактор со стеклянными буса 2-Юв1) 20 192>
ми
Мультиповерхностный реактор 2,5-105 1,1 1,0
Фермеитер со стопой дисков 3,5-Ю5** 1,7 1,3
Пластинчатый теплообменник 2- Ю4---1,5- Ю? 6,7 32)
Микроносители 5 г/л 30- 10в1) 30 242)
15 г/л 2-10611 90 752>
‘) Максимум для известных культуральных систем, но не теоретически возможный. 2) С учетом резервуара и контрольного оборудования.
в) Пробулькивание защищенного фильтром отсека.
Все три системы использовались автором в установке, изображенной на рис. 3.10 для получения культур с Цитодексом-3 в концентрации вплоть до 15 г/л в культуральных сосудах с рабочим объемом от 2 до 20 л. Результаты типичного эксперимента представлены на рис. 3.11.
VI. Общий анализ использования культур с микроносителями. Культуры с микроносителями используются в промышленности для получения вакцин и интерферона в ферментёрах объемом до 1000 л. Для этих процессов используются гетероплоидные или первичные клетки. К сожалению, результаты, полученные
с диплоидными клетками человека, недостаточно хороши, что бы можно было рекомендовать такую процедуру для культивирования этих клеток. Успешное выращивание клеток человека достигается только на оборудовании лабораторного масштаба (менее 20 л), где процессу культивирования можно уделять гораздо больше внимания. Одной из проблем культур большого объема становится необходимость большого количества рассеиваемых клеток. Сбор клеток с больших блоков крупномасштабных культур не всегда проходит очень удачно, хотя использование коллагеновых и желатиновых микроносителей значительно упростило эту проблему. Стоимость микроносителей достигает 1200—1500 фунтов стерлингов за 1 кг. Иногда возможно промывание и повторное использование гранул микроносителей, но это, естественно, невозможно в случае желатиновых и обработанных коллагеназой гранул.
3.7. Заключение
Был рассмотрен широкий диапазон поставляемого фирмами и создаваемого в лабораторных условиях оборудования. Приведенные данные дают возможность сделать выбор, исходя из количества и типа клеток, желаемого продукта, а также предполагаемых масштабов финансирования и количества рабочей ¦ силы. При выборе оборудования советуем учитывать данные, приведенные на рис. 3.6 и в табл. 3.4.
4. Суспензионные культуры
Как уже говорилось, для наращивания клеточной массы удобнее использовать не монослойные, а суспензионные культуры. Некоторые клетки, особенно кроветворные, лучше растут в суспензионной культуре. Другие клетки могут быть адаптированы или отобраны на рост в суспензии. И наконец, небольшая часть клеток, например линии диплоидных клеток человека (Wl-38, MRC-5), вообще не выживает в суспензии. Помимо всего прочего некоторые клеточные продукты могут экспрессироваться, только когда клетки существуют в монослое либо после образования межклеточных контактов (например, для распространения внутриклеточных вирусов по клеточной популяции), что также ограничивает возможность использования ¦суспензионной культуры.
4.1. Адаптация к суспензионной культуре
Различные линии клеток отличаются по способности адаптироваться к росту в суспензии. Для тех линий, которые обла-
дают потенциальной возможностью к росту в суспензии, существуют два основных способа перевода растущих на субстрате клеток в линии клеток, культивируемых в суспензии.
4.1.1. Отбор
С помощью отбора Пауль и Струзерс получили линию клеток LS из клеток L-929, а из клеток HeLa — клетки HeLa-S3. Метод основан на существовании в популяции слабо прикрепляющихся вариантов клеток. Такие клетки при достижении культурой полного монослоя отделяют от пласта легким соскре-банием или осторожным нокачиванием культуральной среды; затем среду собирают, а суспендированные в ней клетки осаждают центрифугированием. Клетки собирают таким способом из многих культур, чтобы получить достаточно большой иноку-лят (по крайней мере 2-105 клеток/мл), для посева новой культуры. Процедуру следует повторить несколько раз в течение долгого периода, поскольку значительное число собираемых клеток не является потенциально способными к росту в суспензии, а отделяется от монослоя потому, что они находились в фазе митоза. Известно, что клетки во время митоза округляются и оказываются слабо прикреплениыми к субстрату. После нескольких циклов сбора слабо прикрепившихся клеток удается выделить популяцию жизнеспособных клеток, растущих и делящихся в суспензии; такие клетки могут оседать на субстрат, но не прикрепляются и не распластываются на нем.
