Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Конки Д. -> "Культура животных клеток" -> 37

Культура животных клеток - Конки Д.

Конки Д., Эрба Э., Френши Р., Гриффитс Б. Культура животных клеток — М.: Мир, 1989. — 333 c.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка): kulturajivotnihkletok1989.djvu
Предыдущая << 1 .. 31 32 33 34 35 36 < 37 > 38 39 40 41 42 43 .. 136 >> Следующая

клеток с микроносителями в стационарной культуре, перемеши-ъая ее каждые 30 мин в течение 30 с. Это, однако, всегда приводило к неравномерному распределению клеток между гранулами микроносителя, и в настоящее время резкое улучшение качества микроносителей позволяет начинать перемешивание немедленно при минимально возможной скорости, обеспечивающей полное перемешивание (10—25 об/мин).
По завершении прикрепления (3—8 ч) объем культуры медленно доводят до рабочего, и скорость перемешивания увеличивается для поддержания полностью гомогенной смеси. При выполнении этих условий и при отсутствии изменений температуры и pH возможна инициация роста культуры на микроносителях для всех клеток, способных расти на пластиковой поверхности.
III. Поддержание культуры. Анализ роста клеток в культуре на микроносителях не представляет никакой проблемы. Легко производится отбор проб, определяется число клеток (по подсчету ядер), концентрация глюкозы и исследуется морфология клеток. По мере роста клеток гранулы микроносителя становятся тяжелее, что требует увеличения скорости вращения. После 3 дней культивирования или около того происходит за-кисление культуры и следует сменить среду. Это также оказывается чрезвычайно простой процедурой: мешалка отключается, гранулам с клетками дают осесть в течение 5 мин и затем удаляется столько среды, сколько нужно. После этого культура осторожно заполняется свежей средой, нагретой до 37 °С, и перемешивание возобновляется.
IV. Сбор клеток. Для многих типов клеток сбор их с микроносителей оказывается весьма трудной задачей, если клетки не достигнут высокой плотности на гранулах. К сожалению, нет оснований ожидать многослойного роста клеток на микроносителях; это случается крайне редко. Сбор клеток начинается с удаления среды, по крайней мере одноразовой промывки гранул с клетками буфером и суспендирования микроносителей с клетками в растворе соответствующего фермента. Культура затем перемешивается при высокой скорости (75—125 об/мин) в течение 20—30 мин. Если клетки открепятся, то значительная их часть может быть собрана, если дать гранулам осесть в течение
2 мин и затем декантировать супернатант. Для более полного отбора смесь переносится в стеклянный фильтр с крупными порами. Клетки будут проходить через фильтр, а гранулы микроносителя задержатся на нем.
Применение новых образцов микроносителей сильно упростило сбор клеток. Получены покрытые коллагеном гранулы Ци-тодекса-3, с которых клетки снимаются коллагеназой. Желатиновые гранулы фирмы Corning могут солюбилизироваться трипсином и/или эгилендиаминтетраацетатом (ЭДТА).
V. Увеличение масштаба культур на микроносителях. Увеличение масштаба может быть достигнуто а) увеличением концентрации микроносителей и б) увеличением размера культур. Если идти по пути а), то возникают быстрое истощение питательных веществ и кислорода в среде и снижение pH до нефизиологических значений. Смены среды не только утомительны, но и
Рис. 3.10. Система перфузии по замкнутому контуру с полным контролем параметров среды для выращивания клеток при высокой концентрации микроносителей. КС-—культуральный сосуд; РЕ — резервуар; К — коннектор для смены среды, сбора и т. д.; Ф — фильтр; ГС — газовый смеситель; У — контроллер уровня; П — устройство для отбора проб; М — магнит; Щ — резервуар со щелочью (NaOH); ОЭ — кислородный электрод; рЭ — pH электрод; Н — насосы; Н1—среда к резервуару (постоянно); Н2 — среда в культуру (контролируется У); НЗ — щелочь к резервуару (контролируется рН-метром); Т — измеритель скорости тока воздуха; гп •—поступление газа для поверхностной аэрации; гв—поступление газа для пробулькивания;
СК — соленоидный клапан; Л — лопасти.
приводят к нежелательным быстрым изменениям окружающих условий. Для получения культур с высокой концентрацией микроносителей следует применять либо проточную перфузию, либо перфузию по замкнутому контуру. А это может быть достигнуто только при использовании высокоэффективных систем фильтрации, чтобы среда без клеток и микроносителей удалялась с высокой скоростью. Единственный удовлетворительный способ достижения этого результата возможен при использовании системы фильтрации, изображенной на рис. 3.10. Система включает в себя сито из нержавеющей стали с диаметром пор 60—120 мкм. Крепление сита на валу мешалки обеспечивает
использование большой площади поверхности фильтра, и его вращение препятствует прикреплению клеток и забиванию пор [17].
Хотя этим способом и можно наращивать большое количество клеток, недостаточность кислорода остается главным фактором, который надо преодолевать. Это особенно сложная проблема в культурах с микроносителями, поскольку в этих
Часы
Рис. 3.11. Рост эпителиальных клеток GRK на Цитодексе-3 (10 г/л) в культуральной системе объемом 10 л, представленной на рис. 3.10.
условиях скорость перемешивания мала (в разд. 2.7 указывалось, что скорость вращения должна превышать 100 об/мин, чтобы это существенно сказывалось на скорости аэрации). Пробулькивание в культурах с микроносителями использовать невозможно, поскольку микроносители выносятся наверх с пузырьками воздуха и подсыхают. Описанный ранее перфузионный фильтр позволяет, однако, проводить пробулькивание в той части культуры, где отсутствуют гранулы микроносителя. К сожалению, это сопровождается тем, что большая часть оксигенированной среды удаляется в результате перфузии. Но при скорости пробулькивания 10 см3 кислорода на 1 л происходит значительная диффузия оксигенированной среды в основную
Предыдущая << 1 .. 31 32 33 34 35 36 < 37 > 38 39 40 41 42 43 .. 136 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed