Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
1,04 1,05 1,05 1,04 ? 1,04
Сферич. Сферич. Сферич. Сферич. Цилиндрич. Сферич.
120---180 160---300 160---230 115---235 Варьирует 150---150
5000 255 250 3800 2---4000 5000
4,0 11 45 3,5 1,5 ---
Сухой не Сухой Сухой Сухой не Влажный не Сухой не
стерильный стерильный стерильный стерильный стерильный стерильный
3.6.3. Гомогенные системы (микроносители)
Когда клетки растут на мелких сферических носителях, они могут рассматриваться как клеточные суспензии и для их выращивания могут применяться процессы и аппаратура, разработанные для суспензионных культур. Культивирование клеток на микроносителях было впервые предложено Ван Везелем [16], использовавшим гранулы декстрана (сефадекс А-50). Полученные результаты не были полностью удовлетворительными из-за неподходящего заряда гранул, а также, по-видимому, вследствие токсических эффектов. Однако проведенная с тех пор большая исследовательская работа привела к тому, что в настоящее время в широкой продаже имеются многие типы подходящих микроносителей (табл. 3.3).
Практические исследования авторов были связаны преимущественно с микроносителями цитодекс (Pharmacia), так что большая часть обсуждения будет связана именно с этими продуктами. Выбор микроносителей этого типа был обусловлен
а) предпочтением к сухому продукту, который мог быть аккуратно взвешен и затем подготовлен in situ, и б) низкой плотностью этого продукта (1,03 г/см3), позволяющей использовать его в концентрации до 15 г/л (90 000 см2/л). Однако наше расположение к цитодексам не снижает ценности других микроносителей, многие из которых могут быть использованы с равным успехом.
I. Аппаратура для культивирования. Стандартные сосуды с перемешивающим цилиндром непригодны для этого типа культур без модификации системы перемешивания. Необходимы мешал-
ки с большой площадью поверхности лопастей. Такие системы поставляются фирмой Bellco (Беллко [г-сосуд с мешалкой; см. рис. 3.12), но могут быть легко изготовлены самостоятельно из листа силиконовой резины, присоединенной к покрытому пластиком магниту. Преимущество создания мешалки в лабораторных условиях заключается в возможности отклонения лопастей от вертикали на 20—30°, что обеспечивает значительно лучший
cl5
¦ -'».L
Мешални с приводом от внешнего двигателя
\
Г\ПГ\Г
/
~ППР
ч
С_Ь
г
Рис. 3.8. Типы мешалок для выращивания клеток в суспензии или на микроносителях. (А) турбина с плоскими лопастями, д2:д1 = 0,33, радиальное турбулентное перемешивание; (Б) морской винт, д2:д1 = 0,33, аксиальное турбулентное перемешивание, угол 25°; (В) вибро-миксер; (Г) перемешивающая палочка, д2:д1 = 0,6, радиальное ламинарное перемешивание; (Д) вертикальная и (Е) угловая (25°) лопасти, д2:д1 = 0,6—0,9; аксиальный и радиальный ток жидкости, ламинарное и турбулентное перемешивание; д2 — диаметр мешалки, д1—диаметр сосуда.
Магнитные мешалки
подъем микроносителей и перемешивание по сравнению с вертикально расположенными лопастями (рис. 3.8). Культура с микроносителями перемешивается очень медленно (V^ ^75 об/мин), поэтому необходимо использовать магнитные мешалки высокого качества, обеспечивающие плавное перемешивание в диапазоне скоростей 20—100 об/мин. Нельзя использовать перемешивающие механизмы, в которых движущиеся поверхности соприкасаются друг с другом в среде: это может привести к разрушению микроносителей. Поэтому для культур с микроносителями непригодны сосуды с помещенным на дно вращающимся магнитом. Поскольку перемешивание, а следовательно, и перемещение массы в таких культурах очень слабое, глубина среды не должна превышать диаметр сосуда более чем в два раза, если только не предусмотрена система оксигениро-
вания или регулярная смена среды. В основных культуральных системах смена среды должна производиться достаточно часто. Это заставляет предусмотреть соответствующие подсоединения к культуральному сосуду, обеспечивающие удобную смену среды in situ. Одновременно при этом снижается риск занесения в культуру микроорганизмов. Упрощенная установка для культивирования на микроносителях представлена на рис. 3.9.
Рис. 3.9. Простые системы культур на микроносителях, обеспечивающие легкую смену среды. Для заполнения культурального сосуда К открыть вентиль Л1 и перекачать среду из резервуара Р, нагнетая воздух через трубку А. Для отбора клеток остановить на 5 мии мешалку, открыть вентиль JI2 н перекачать среду из К в Н, нагнетая воздух через трубку Б. П — устройство для отбора проб.
II. Посев культуры. При посеве культуры с микроносителями критичными оказываются многие факторы, перечисленные в разд. 2. Микроносители имеют сферическую форму, а клетки всегда прикрепляются к участкам с минимальиой кривизной. Хотя поверхность микроносителей не может быть идеальной, но она обязана быть приемлемой по своим химическим и физическим свойствам. Убедившись в том, что среда и гранулы находятся при оптимальных pH и температуре, вносите в культуру клетки (с логарифмической, но не со стационарной фазы культуры) в объеме среды, составляющем треть конечного объема. Это увеличивает вероятность контакта клетки с микроносителем. Конечная концентрация микроносителей должна составлять 2—3 г/л, а более высокие концентрации требуют повышенного контроля условий культивирования и очень частых смен среды. Раньше предпочитали проводить связывание
