Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
и обеспечивает выход 1—2-109 клеток при посевё 1 -108 клеток. Для диплоидных клеток система оказывается нё столь удобной. Главным моментом при использовании этой/системы является равномерность распределения клеток по прверхности спирали; в противном случае рост клеток будет неравномерным и выход снизится. Рост клеток можно наблюдать только на внешней поверхности спирали, и при неравномерном распределении клеток обследование внешней поверхности может приводить к неправильной оценке числа клеток.
3.4.2. Стеклянные трубки
Примером небольшой культуры может служить культуральная система Bellco-Corbeil (Bellco Glass Inc.), первоначально разработанная Корбейлом [9]. Во вращающуюся бутыль помещается пучок параллельных мелких стеклянных трубок, разделенных силиконовыми прокладочными кольцами. Фирма поставляет три варианта системы с рабочей поверхностью 5• 103,
1 -104 и 1,5¦ 104 см2. Сосуд перфузируется средой из внешнего резервуара. Оригинальность системы заключается в чередовании вращения на 360° по часовой стрелке и против часовой стрелки. Это позволяет отказаться от использования специальных крышек для подведения перфузионной среды.
Примером использования такой системы является получение 3,2-109 клеток Vero (2,3-105/см2) в течение б сут с использованием 6,5 л среды (скорость перфузии 50 мл/мин) и варианта сосуда с поверхностью роста 10 ООО см2.
Аналогично устроена система Gyrogen (Chemap A. G). Фирма поставляет системы шести размеров с рабочей поверхностью от 0,52 до 34 см2. Мелкие блоки заключены в стеклянные сосуды, а более крупные вмонтированы в цилиндры из нержавеющей стали, обеспечивающие вращение, контроль условий культивирования, микроскопическое обследование и стерилизацию in situ.
3.4.3. Пластины
В настоящее время эти системы редко используются, но здесь приводится их описание, поскольку лежащие в их основе принципы нахддят применение в крупных установках и они могут быть легко созданы в лабораторных условиях. Фирма Linbro поставляет патроны из 40 дисков, расположенных параллельно на центральном стержне. Это обеспечивает рабочую поверхность 6300 см2 во вращающемся сосуде размерами 12X22 см. Сосуд наполовину заполняется средой и используется как обычная вращающаяся бутыль.
Значительно более крупный вариант с использованием титановых дисков, обеспечивающий общую рабочую поверхность
1,7 м2, поставляется фирмой Biotec Inc. Эта система в настоящее время почти не используется, так как пласты клеток, достигшие полного монослоя, часто отделяются от диска. Однако принципы этой системы были перенесены в ферментёр со стопой пластин (разд. 3.6.2). Главным недостатком систем с вертикальными пластинами является сложность достижения равномерного прикрепления клеток при заполнении сосуда наполовину.
3.5. Наращивание клеток; этап 3, стационарные культуры большой емкости
3.5.1. Многоппастинчатый блок {A S NUNC)
Стандартный многопластиичатый блок состоит из 10 камер с рабочей поверхностью 600 см2 каждая. Камеры скреплены друг с другом и снабжены соединяющими их каналами. Это позволяет проводить каждую операцию для всех камер одновременно. Следовательно такой блок можно рассматривать как сосуд с рабочей поверхностью 600 см2, использующий 2 л среды и занимающий объем 12 500 см3. Этот блок удобен для практического использования и позволяет получать такие же хорошие результаты, как и при выращивании в пластиковых флаконах. Блок сделан из полистирола и предназначен для одноразового использования. Один из недостатков этой системы может обернуться ее преимуществом. На практике бывает трудно удалить все клетки после их открепления от подложки трипсином или другими агентами. Однако остающиеся в блоке клетки можно использовать в качестве инокулята для новой культуры при добавлении свежей среды. С помощью надежной асептической техники сбора клеток этот блок одноразового пользования может быть повторно задействован 3—4 раза. Система нескольких соединенных между собой блоков используется в промышленности для производства интерферона [10]. Кроме того, поставляются также блоки с рабочей поверхностью 1200 :: 24 000 см2.
3.5.2. Культуры на полых волокнах
Пучки синтетических полых волокон являются таким же матриксом, как и сосудистая система, и позволяют клеткам достигать плотности, сходной с таковой в ткани. Полые волокна обычно используются в ультрафильтрации благодаря способности к селективному проникновению макромолекул через пористую стенку волокон при постоянном протекании жидкости через
просвет волокна. Если пучок таких волокон поместить в патрон и закрыть с обеих сторон, то при пропускании через патрон культуральной среды она будет проникать через стенки волокон, обеспечивая большую поверхность для прикрепления и роста клеток.
Культуральные камеры, построенные по этому принципу (витафибр), поставляются фирмой Amicon Corporation. Капиллярные волокна изготавливаются из акрилового полимера, имеют диаметр 350 мкм и толщину стенки 75 мкм. Поры в стенках волокон ограничивают проникновение макромолекул с мол. массой между 10 000 и 100 000 дальтон. Определить общую поверхность такого блока, доступную для роста клеток, трудно. Однако фирма поставляет блоки разного размера, и они характеризуются очень высоким отношением рабочей поверхности к объему культуральной среды (около 30 см2/см3). В этой системе можно вырастить до 108 клеток/мл.
