Фотобиология - Конев С.В.
Скачать (прямая ссылка):
скорости дейтериевого обмена, устойчивости к протеолитическим ферментам и
теплу, количества титруемых кислых, основных и SH-групп, изучения
иммунологических свойств.
В ряде работ отмечается четкая корреляция между степенью инактивации и
денатурации белков. Однако не
5. Триптофановая фотоинактивация
263
для всех белков и не при всяких условиях к инактивации ведут
генерализованные по всей структуре конформационные перестройки. Иногда
бывает достаточно локальных структурных изменений. Так, инактивация
уреазы и трипсина не нарушает их комплексирования с антителами, а
квантовый выход фотоденатурации трипсина, по данным седиментации, в 2-5
раз ниже квантового выхода фотоинактивации. По данным Аугенштейна,
эффективная энтальпия (АН*) активации ингибирования трипсина УФ-светом
сильно зависит от химической природы субстрата, по деструкции которого
оценивается остаточная ферментативная активность. Было показано, что для
этилового эфира бензоиларгина и казеина АН* составляет соответственно 2,5
и 4,7 ккал/моль. Поскольку в опытах Аугенштейна субстрат добавлялся после
облучения фермента, то фотофизика и фотохимия инактивации белка во всех
случаях были одинаковы, а наблюдавшиеся различия в квантовых выходах
инактивации указывали на локальный характер нарушения конформации,
которое по-разному сказывалось на центрах сорбции субстратов.
По-видимому, фотоденатурация (локальная или генерализованная) белков
может осуществляться и нефотохимическим путем, минуя стадии лабильных и
стабильных фотопродуктов при тепловой диссипации энергии электронно-
возбужденных состояний триптофанилов (около 100 ккал/моль), ведущей к
множественным разрывам водородных и иных связей. Так, было обнаружено,
что аргиназа и уреаза, обладающие, как и другие белки, способностью к
существованию в двух дискретных функционально активных конформациях в
области физиологически умеренных температур (кооперативный переход Ач^В),
различаются по квантовым выходам фотоинактивации температурных
конформеров А и В. Однако скорости фотолиза триптофанилов и цистина, а
также природа конечных стабильных фотопродуктов (данные люминесценции) у
температурных конформеров оказались одинаковыми. Отсюда следует, что
различия в фоточувствительности конформеров могут быть связаны с
дополнительной нефотохимической инактивацией макромолекулы.
264 Глава XIII. Действие УФ-света на белки
Скорее всего по этой же причине происходит умень-ШСНИ6 ?акт
фотоинактивации (А,= 254 нм) трипсина после дейтерирования,
соответствующее, по данным ИК-спек-троскопии, разности энергии N-Н- и N-
D-колебаний. Иными словами, у дейтерированного трипсина облегчен разрыв
водородных связей энергией, поглощенной цистином. Сходным образом может
быть объяснено уменьшение квантового выхода фотоинактивации трипсина на
фоне постоянной скорости фотолиза триптофанилов при изменении вязкости и
ионного состава среды, амилазы при образовании фермент-субстратного
комплекса, а также гексокиназы при ее комплексировании с регуляторным
гормоном инсулином.
Можно думать, наконец, что и отмеченная ранее Мак Лареном сильная
зависимость квантовых выходов инактивации белков от pH, ионной силы и
состава буфера связана не только с характером их воздействия на
фотохимические реакции, но и с изменением вероятности прямой тепловой
фотоденатурации.
6. ЦИСТИНОВАЯ ФОТОИНАКТИВАЦИЯ
Поглощение квантов УФ-света цистином сопровождается возникновением
свободных радикалов с локализацией неспаренного электрона на атоме серы
(R-S- и R-S-S). Методом электронного парамагнитного резонанса такие
радикалы обнаружены как в модельных соединениях (цистин, цистеин,
глютатион), так и в белках. Проведенный Дозе химический анализ
фотохимических продуктов показал, что при фотолизе цистина разрываются S-
S-связи:
+ 2Н
R - S - S - R + ftv -2R,- БЦ.
Эта реакция восстановления цистина до цистеина идет, следовательно, через
стадию образования свободных радикалов.
Квантовый выход фотолиза цистина в растворе на два-три порядка выше, чем
триптофана, и составляет, по данным Дозе, Мак Ларена и Льюза, 0,11 и 0,13
соответственно. В белках квантовый выход фотолиза цисти-
6. Цистиновая фотоинактивация
265
на еще выше и колеблется от 0,18 в инсулине до 0,75 в химотрипсиногене.
Возбужденные молекулы цистина в растворе способны диссоциировать не
только по -S-S-, но и по -С-S-связи:
/IV
-С - S-S - с - --- CH + C-S-S - н.
+2Н
Фотолиз дисульфидной связи может происходить при поглощении квантов как
самим цистином, так и ароматическими аминокислотами. На это указывает
возраста-ние квантового выхода фотолиза цистина в белках при переходе от
облучения с длиной волны 254 нм к облучению с длиной волны 280 нм (с
расчетом только на его собственное поглощение). Аналогичная
сенсибилизация наблюдается и в модельных системах - смеси цистин +
+триптофан и цистин+тирозин, причем квантовый выход сенсибилизации
достигает 0,02.
Очевидно, причиной такой сенсибилизации не может быть индуктивно-
