Фотобиология - Конев С.В.
Скачать (прямая ссылка):
флуоресцирует с квантовым выходом, равным 0,2, и длительностью 3,4-10~9
с. Максимум спектра флуоресценции тирозина в воде и белках расположен при
303 нм. Квантовый выход флуоресценции тирозина в белках очень низок из-за
различных эффектов тушения, в основе одного из которых лежит образование
водородной связи между фенильным гидроксилом и ближайшей ионизированной
карбоксильной группой.
Длинноволновая полоса я-я*-поглощения фенилаланина обнаруживает максимум
при 258 нм и характеризуется низкой молярной экстинкцией (е=200).
Фенилаланин обладает чрезвычайно слабой флуоресценцией (В=0,04), максимум
спектра которой располагается при 282 нм. Флуоресценция фенилаланина в
белках обычно не проявляется.
Поглощение УФ-света цистином, который не содер-жит двойных связей, а
следовательно, и я-электронов, обусловлено а-а*-переходом. В области 200-
300 нм спектр поглощения описывается монотонной кривой с возрастанием
экстинкции по мере уменьшения длины волны. В области провала в спектрах
поглощения триптофана и тирозина (250 нм) экстинкция цистина составляет
около 200. Цистин не способен к флуоресценции и
248
Глава XIII. Действие УФ-света на белки
фосфоресценции и не передает миграционным путем поглощенную энергию
триптофанилам.
2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФОТОИНАКТИВАЦИИ БЕЛКОВ
Конечным результатом действия ультрафиолетового света на белки является
их инактивация, т. е. потеря ферментативной, регуляторной, гормональной,
транспортной и иммунологической активностей. Фотоинактивация белков
представляет собой одноквантовый, одноударный необратимый процесс, о чем
свидетельствует экспоненциальный характер зависимости ферментативной
активности от дозы облучения и взаимозаменяемость интенсивности и времени
облучения. На одноударность процесса указывает также линейная зависимость
скорости инактивации от интенсивности света, выполняющаяся даже при таких
его интенсивностях, когда количество квантов, падающих в секунду на
единицу объема, сравнимо с количеством молекул белка в нем.
Квантовые выходы инактивации различных белков характеризуются достаточно
низкими значениями, находящимися в пределах 10~2-10_3. Это означает, что
только один удачно поглощенный квант инактивирует макромолекулу, в то
время как поглощение остальных 99-999 квантов не приводит к функционально
существенным повреждениям. Квантовый выход фотоинактивации белков не
зависит от содержания кислорода. Следовательно, инактивация не
обусловлена фотоокисле-нйем хромофоров. Скорость фотоинактивации белков
практически не зависит от температуры (Qio^l), во всяком случае для тех
интервалов положительных температур, при которых конформация белка
остается неизменной. Квантовый выход инактивации возрастает в области
предденатурациониых температур и уменьшается в 3-4 раза при охлаждении
образцов до -196° С. Эффективность фотоинактивации контролируется
концентрацией водородных ионов (pH) и ионной силой среды, зависит от
состава используемого буфера, а также от присутствия в растворах
мочевины, гуанидина и детергентов. Перевод белка из раствора в твердую
собст-
3. Роль хромофоров в фотоинактивации белков
249
венную пленку сопровождается падением квантового выхода" инактивации
примерно в 3 раза. Обработка теплом и кислородом некоторых белков,
облученных в вакууме, приводит к дополнительной темновой инактивации,
которая объясняется накоплением в белках скрытых повреждений. На
существование скрытых повреждений указывает также изменение
чувствительности УФ-облученных ферментов к 5 М мочевине: облученные и
необлученные белки инактивируются мочевиной с различной эффективностью.
3. РОЛЬ ОТДЕЛЬНЫХ ХРОМОФОРОВ В ФОТОИНАКТИВАЦИИ БЕЛКОВ
Основную информацию о природе акцепторов биологически активного света
дает метод спектров действия.
180 220 260 300 К, нм
Рис. 47. Спектры действия инактивации растворов альдолазы (/),
грамицидина (2) и пленки химотрипсина (3) (McLaren A., Shugar D.,
1964)
Рис. 48. Спектр действия инактивации трипсина в пленке (1) и спектры
поглощения трипсина (2) и цистина (3) (Setlow R., Doyle В., 1957)
В спектрах действия инактивации самых разнообразных белков отчетливо
представлена полоса поглощения ароматических аминокислот при 280 нм (рис.
47). Непо-
250 Глава XIII. Действие УФ-света на белки
средственное участие триптофанилов в фотоинактивации белков
подтверждается также защитным действием красителей - миграционных
акцепторов энергии триптофанилов. При этом степень защиты пропорциональна
тушению флуоресценции, т. е. уменьшению концентрации возбужденных молекул
триптофана. Протективное действие обусловлено индуктивно-резонансной
миграцией энергии с синглетных возбужденных уровней триптофанилов к
синглетным уровням красителя. Наконец, для отдельных белков отмечается
совпадение скоростей фотоинактивации белков и фотолиза триптофанилов в
них.
Вклад фотохимии цистина проявляется в увеличении поперечного сечения
инактивации богатых цистином белков в области 250 нм (рис. 48), где
