Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Конев С.В. -> "Фотобиология" -> 110

Фотобиология - Конев С.В.

Конев С.В., Волотовский И.Д. Фотобиология — Мн.: БГУ, 1979. — 385 c.
Скачать (прямая ссылка): fotobiologiya1979.djvu
Предыдущая << 1 .. 104 105 106 107 108 109 < 110 > 111 112 113 114 115 116 .. 144 >> Следующая

экспериментам Уэбина и Маддена, обнаруживших в дрожжевых клетках особые
флуоресцентные активаторы, содержа-
294 Глава XVII. Репарация фотоповреждений в клетке
ние которых точно соответствует количеству фотолиазы. В спектре
возбуждения флуоресценции этого вещества обнаруживаются максимумы при 280
и 358 нм. Активатор примерно в 2 раза увеличивает эффективность высоко-
очищенной фотолиазы и не оказывает никакого эффекта при добавлении к
препаратам энзима, еще не подвергнутым дополнительной очистке. Не
исключено, что данный активатор, по всей видимости и являющийся
хромофорной группировкой фотолиазы, теряется в ходе очистки энзима.
Именно поэтому не удавалось обнаружить какого-либо ощутимого поглощения у
очищенного фермента в области спектра 320-450 нм.
Прямые указания на существование активатора (кофактора) в составе
фотолиазы получены также Г. Б. За-вильгельским. Для получения
высокоочищенных препаратов фотореактивирующего фермента им была
использована изящная методика, основанная на различии констант связывания
фотолиазы с субстратом (пиримидиновые димеры в ДНК) и необлученной ДНК. В
раствор, содержащий фотолиазу, опускалась УФ-облученная пленка,
приготовленная из "сшитой" ДНК, при этом фотолиаза избирательно
комплексировала с пиримидиновыми димерами ДНК- Затем пленка
последовательно помещалась в буферные растворы с возрастающей ионной
силой. Сначала смывались неспецифически адсорбированные на ДНК белки, а
при ионной силе 0,2-0,4 - фотолиаза. Высокоочшценный препарат фермента
обнаруживал в спектре поглощения кроме белкового (278 нм) дополнительные
максимумы приблизительно при 330, 370 и при 418 нм, которые можно было
приписать кофактору. Препарат люминесцировал с максимумами спектра
флуоресценции при 435 и возбуждения флуоресценции при 355 нм.
Исходя из вышеописанных данных, можно допустить, что фотолиазы в клетке
находятся в стехиометрическом комплексе с активатором (кофактором) и что
свет, поглощаемый активатором, каким-то образом (возможно, через
конформационное возмущение фермента или через использование энергии
электронно-возбужденного состояния для нужд катализа) увеличивает
ферментативную активность в значительно большей степени, чем свет,
поглощенный самим ферментом.
1. Фотореактивация
295
Иным образом объясняет несоответствие спектров действия фотореактивации и
поглощения фотолиазы американский исследователь Сазерленд. По ее мнению,
поглощением в области 320-450 нм обладает не сама фотолиаза и не какая-
нибудь слабосвязанная с ней группировка, а комплекс фермента с облученной
ДНК. В качестве доказательства этого положения Сазерленд приводит
результаты спектрофотометрических измерений, в которых для комплекса
облучения фотолиаза+ДНК были зарегистрированы изменения поглощения в
области спектра 320-420 нм. В противоположность этому в контрольном
варианте опыта (фотолиаза+ необлученная ДНК) никаких изменений поглощения
обнаружить не удалось.
Как уже упоминалось, фотореактивирующий энзим обладает повышенным
сродством к пиримидиновым димерам и его действие сводится к их
мономеризации. С наибольшей скоростью мономеризуются димеры тимина,
с меньшей - смешанные димеры Ц-Т и Т-У и с еще
Г"" ' -у f--
меньшей - димеры У-У и Ц-Ц. Другие продукты димерной природы, например
"споровый" продукт или сшивки ДНК-ДНК и ДНК - белок, не фотореактиви-
руются.
Как и при всякой ферментативной реакции, между ферментом и субстратом
(облученной ДНК, или синтетическим полинуклеотидом) в темноте образуется
устойчивый комплекс, который может быть выделен путем
ультрацентрифугирования или гельфильтрации. Размеры сорбционного центра
фермента достаточно велики, поскольку фрагменты политимидиловой кислоты,
содержащие менее девяти мономеров, с ним не комплексируют. В отличие от
обычных ферментативных реакций каталитический акт в фермент-субстратном
комплексе фотореактивирующий энзим - облученная ДНК не протекает без
видимого света, т. е. фермент работает в электронно-возбужденном
состоянии. Прн постоянной интенсивности света реакция мономеризации
подчиняется кинетическому уравнению Михаэлиса - Ментена:
hv
E + S ;zzl! ES Е + Р.
' *2 *
296 Глава XVII. Репарация фотоповреждений в клетке
По данным Харма, для ДНК Е. coli в клетке &i = l,lX ХЮ-(r) л• моль-1 • с-1,
k-i= 1,9- 10~3-М,3-10~2, энергия активации образования фермент-
субстратного комплекса равна 11, а его распада - 4,5 ккал/моль.
Принципиальное сходство механизмов фотореактивации in vivo и in vitro
доказывается опытами с мутантами: штамм Е. coli phr-, дефектный по
фотореактивирующему энзиму, не только сам не обладает способностью к
фотореактивации, но и его экстракты лишены этой способности в модельных
опытах.
Фотореактивация второго типа (фотореактивация II, или непрямая
фотореактивация) не насыщается при высоких интенсивностях света и
характеризуется спектром действия с максимумом при 340-350 нм. В
противоположность фотореактивации I фотореактивация II не зависит от
Предыдущая << 1 .. 104 105 106 107 108 109 < 110 > 111 112 113 114 115 116 .. 144 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed