Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
202
бирках доводят дистиллированной водой до 10 мл и стерилизуют, как стандартный ряд.
Контрольные образцы. 2 мл обработанного материала в пробирке смешивают с 2 мл 0,2 н. раствора NaOH и кипятят в водяной бане в течение 30 мин. После охлаждения доводят pH раствора до 6,8—7,0 при помощи 10—12 капель 0,2 н. раствора HCl или 0,2 н. раствора NaOH и фильтруют через беззольный фильтр с последующим промыванием дистиллированной водой. Фильтрат переливают в пробирку, содержащую 5 мл опытной среды, дополняют дистиллированной водой до 10 мл и стерилизуют, как и опытные образцы. Для каждого исследуемого материала готовят два таких образца.
Посев. В стандартный ряд исследуемые и контрольные образцы вносят по одной капле из одной и той же пипетки бактериальной взвеси, приготовленной следующим образом. Две центрифужные пробирки с 5 мл опытной среды и 5 мл стандартного раствора витамина В]2 (50 пкг/мл в каждой) стерилизуют в кипящей водяной бане в течение 30 мин и после охлаждения засевают Е. coli с твердой агаровой средой. Засеянные пробирки ставят в термостат при 37 0C на 20—24 ч. Затем бактериальную суспензию центрифугируют 15—20 мин при 4000 мин . Жидкость смывают, осадок промывают, центрифугируя с физиологическим раствором NaCl. Осадок суспендируют в 2 мл физиологического раствора NaCl и полученную взвесь используют для посева. Все пробирки на 20—24 ч помещают в термостат при 37 °С.
Учет интенсивности роста Е. coli. По окончании инкубации содержимое каждой пробирки взбалтывают и замеряют мутность на фотоэлектроколориметре (ФЭК-М) при синем светофильтре по шкале, показывающей процент пропускания света. По полученным данным строят калибровочную кривую. При построении стандартной кривой лучше не соединять все полученные точки, а провести плавную кривую между ними. По величине светопропус-кания трех параллельных пробирок (берут среднее арифметическое) на оси абсцисс находят соответствующее количество витамина в данной пробирке. Для этого откладывают на оси ординат среднее значение мутности для каждой точки стандартного раствора витамина Bj2, содержащегося в данной пробирке. Затем, учитывая количество обработанного материала, высчитывают концентрацию витамина Bi2 умножением на разведение. Из полученных величин берут среднюю, а из полученной средней вычитают полученную в контрольном опыте.
Точность и воспроизводимость метода при прочих равных условиях в значительной степени зависят от применяемой культуры Е. coli, чувствительность которой к витамину B]2 может значительно меняться в зависимости от условий культивирования — частоты пересева, качества твердой среды, температурного режима и других факторов.
Источники: 38, 56.
203
Клиническое значение. Витамин B]2 синтезируется микроорганизмами рубца и кишечника. Для синтеза цианкобала-мина используют микроэлемент кобальт. В тканях кобаламин образует коферментные формы: метилкобаламин и дезоксиаденозин-кобаламин, которые участвуют в реакциях образования метионина, превращения метилмалонил-КоА в сукцинил-КоА, в образовании коферментных форм фолацина, а следовательно, в синтезе ДНК и в пролиферации кроветворных клеток.
Недостаток кобаламина отмечается при дефиците протеина, кобальта, болезнях желудочно-кишечного тракта, сопровождаемых нарушением микробиального синтеза витамина Bj2. Гиповитаминоз Bi2 характеризуется нормо- или гиперхромной мегалобластической анемией, плохим усвоением белка и как следствие этого исхуданием, снижением в крови, тканях, рубцовом содержимом концентрации кобаламина.
Содержание витамина B12 в различных материалах (по данным Львовской государственной академии ветеринарной медицины)
Содержимое рубца жвачных животных 5—12 мкг%
Печень крупного рогатого скота 300—600 мкг/кг
Почки крупного рогатого скота 200—500 мкг/кг
Мышцы крупного рогатого скота 10—18 мкг/кг
Печень свиньи 60—84 мкг/кг
Кровь крупного рогатого скота 10—18 нг%
Кровь свиньи 5—14 нг%
При гиповитаминозе Bj2 кобаламина в крови телят и поросят содержится менее 78 нмоль/л, в печени — менее 0,1 мкг/г; выделение метилмалоновой кислоты с мочой возрастает до 30 мкг/л (В. В. Яшин).
3.3.10. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ
В целях оценки обеспеченности организма животных микроэлементами помимо анализа содержания их в кормах нередко прибегают к определению их количества в крови, молоке и других биологических субстратах.
Для определения марганца, цинка, железа и других микроэлементов используют химические, атомно-абсорбционные, полярографические и другие методы.
Определение кобальта в крови по методу С. И. Гусева в модификации А. А. Титовой. Принцип. Метод основан на получении окрашенного комплекса кобальта с 2-(2-пиридилазо)-5-диэтилмета-аминофенолом (ПААФ) при pH 5, экстракции его хлороформом и измерении оптической плотности среды.
204
Для устранения влияния других микроэлементов, реагирующих с ПААФ, их окрашенные комплексы разрушают 5 моль/л раствором серной кислоты.
Реактивы: 20%-ный раствор натрия цитрата (х. ч.);
3 моль/л раствор натрия ацетата трехводного (х. ч.). 408 г соли растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до 1 л;
