Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
200
бавляют к 50 мл дистиллированной воды, отсюда берут 1 мл);
ж) агар-агар — 1,5 г; з) витамин B12 (из ампулы, содержащей 100 мкг/мл, берут 0,1 мл) — 10 мкг; и) вода дистиллированная — 100 мл.
После подогревания на водяной бане до растворения агара вносят витамин Bi2, смесь тщательно перемешивают, разливают в пробирки по 50 мл и стерилизуют в автоклаве 15 мин при 105 Па (1 атм);
3) основная среда. Состав основной среды на 1 л: а) калий фосфорнокислый двузамещенный (K2HPO4) — 14 г; б) калий фосфорнокислый однозамещенный (KH2PO4) — 6 г; в) натрий лимоннокислый (CoH5OyNa3 • 5H2O) — 1 г; г) магний сернокислый (MgSO4 х X 7H2O) — 0,2 г; д) аммоний сернокислый [(NH4J2SO4] — 2 г; е) натрия хлорид (NaCl) — 1,0 г, ж) калия цианид (KCN) — 2 мг;
з) вода дистиллированная — до 1 л.
Указанные ингредиенты растворяют последовательно в дистиллированной воде. Калия цианид добавляют в виде раствора, в 1 мл которого содержится 0,1—0,2 мг. Конечный pH среды должен быть в пределах 6,8—7,0. Во избежание потемнения при повторных стерилизациях растворы солей и глюкозы (4 г на 1 л дистиллированной воды) готовят и стерилизуют отдельно кипячением в течение 30 мин. Непосредственно перед опытом оба раствора, т. е. основную массу с калия цианидом и раствор глюкозы, смешивают в соотношении 1:1;
4) агар;
5) ацетатный буфер. Готовят растворением в ацетате натрия тригидрата 13,61 г и 6 г 100%-ной уксусной кислоты в 1 л дистиллированной воды;
6) 1 н. раствор NaOH;
7) 0,2 н. раствор NaOH;
8) 1 н. раствор HCl;
9) 0,2 н. раствор HCl;
10) толуол;
U) витамин Bi2 в ампулах, применяемый для терапевтических целей;
12) дистиллированная вода.
Оборудование: термостат; сушильный шкаф; автоклав; аналитические весы; водяная баня; фарфоровые ступки и пестики; бюретки; мерные колбы на 100, 250 и 1000 мл; мерные цилиндры на 100 мл; воронки; стаканчики на 150—200 мл; пипетки; промывная колба; беззольные фильтры; пробирки 20 х 160 мм; центрифужные пробирки: марлево-ватные пробки; бактериальная петля.
Ход определения. Обработка содержимого рубца. Содержимое рубца разводят дистиллированной водой в соотношении 1 :100. К 1 мл разведения, взятого в пробирку, добавляют 1 мл ацетатного буфера с pH 4,63 и доводят водным раствором калия цианида (концентрация 1,2 мг/л) до объема 20 мл. Пробирку закупо-
201
ривают пробкой, перемешивают содержимое и помещают на 15 мин в кипящую баню. После остывания содержимое пробирки взбалтывают и фильтруют через сухой беззольный фильтр в сухую стерильную пробирку. Фильтрат должен быть совершенно прозрачным. Его pH при помощи 1 н. раствора NaOH и 0,2 н. раствора HCl доводят до 6,8—7,0. Этот фильтрат в случае необходимости может храниться в холодильнике в закрытой пробирке до 7 дней.
Обработка ткани печени. Ткань печени, замороженную в жидком кислороде или азоте, растирают в фарфоровой ступке. Берут навеску 100 мг и тщательно растирают с 0,5 мл ацетатного буфера и небольшим количеством вышеупомянутого раствора калия цианида, переносят в колбочку и доводят раствором последнего до 50 мл. Затем колбочки закрывают марлево-ватными пробками и помещают на 15 мин в кипящую водяную баню, дают остыть, фильтруют, разводят дистиллированной водой 1:10 000 и при помощи 1 н. раствора NaOH или 0,2 н. раствора HCl доводят pH до 6,8—7,0.
Обработка ткани мышц. Ткань мышц, замороженную в жидком кислороде или азоте, растирают в фарфоровой ступке. Берут 200 мг ее и тщательно растирают с 1 мл ацетатного буфера и небольшим количеством раствора калия цианида, переносят в колбочку и доводят этим раствором до 20 мл. Затем колбочку закрывают марлево-ватными пробками и помещают на 15 мин в кипящую водяную баню, дают остыть, фильтруют и при помощи 1 н. раствора NaOH или 0,2 н. раствора HCl доводят pH до 6,8—7,0.
Приготовление стандартного раствора витамина Bj2- Для получения калибровочной кривой используют водный раствор витамина Ві2, в 1 мл которого содержится 0,1 мкг витамина. Раствор хранят в холодильнике с притертой пробкой под слоем толуола. В день опыта делают дальнейшее разведение в 2000 раз до содержания 0,00005 мкг витамина Bi2 в 1 мл (50 пкг).
Постановка опыта включает приготовление стандартного ряда исследуемых и контрольных образцов.
Стандартный ряд. По стандартному ряду строится стандартная (калибровочная) кривая. Для стандартного ряда готовят 30 одинаковых пробирок (размером 20 х 160 мм). В каждую пробирку наливают 5 мл основной среды и возрастающее количество раствора витамина Bj2 концентрации 50 пкг/мл, а именно 0, 0,5, 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5 мл и дополняют дистиллированной водой до 10 мл. Пробирки с раствором закрывают марлево-ватными пробками и стерилизуют в кипящей водяной бане в течение 30 мин, дают остыть и до посева сохраняют при комнатной температуре.
Исследуемые образцы. Для каждого исследуемого образца берут 6 пробирок (таких же, как для стандартного ряда). Затем в пробирки вносят по 5 мл основной среды и добавляют различные количества исследуемого материала (экстракта) — 0,5; 1,0; 1,5 мл, а на каждую градацию берут две пробирки. Объем раствора во всех про-
