Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
198
Определение витамина С в плазме крови. Принцип. Аскорбиновая кислота (витамин С) восстанавливает трехвалентное железо в двухвалентное. Последнее образует с а,сс'-дипиридилом комплексное соединение розового цвета.
Реактивы: 5%-ный раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ). 5 г ТХУ растворяют в 95 мл дистиллированной воды;
40%-ный раствор ТХУ. 40 г ТХУ растворяют в 60 мл дистиллированной воды;
3%-ный раствор железа хлорного (FeCl3). 1,5 г FeCl3 растворяют в 50 мл дистиллированной воды. Хранят не более 3 сут; '-
1%-ный раствор а,сс'-дипиридила. В воде сс,сс'-дипиридил растворяется плохо, поэтому навеску его необходимо смочить 96%-ным этиловым спиртом. К 0,5 г а,сс'-дипиридила приливают 4 мл спирта, а затем в мерной колбе на 50 мл доливают дистиллированной водой до метки;
85%-ная фосфорная кислота (орто);
аскорбиновая кислота.
Оборудование: фотоэлектроколориметр; центрифуга; центрифужные пробирки; мерные колбы на 50 и 100 мл.
Ход определения. К 2 мл плазмы крови добавляют 0,3 мл охлажденного 40%-ного раствора ТХУ, перемешивают стеклянной палочкой и оставляют на 10 мин на холоде (в воде со льдом) с целью более полной денатурации белков. Центрифугируют 20 мин при 2000 мин-1. К 1 мл надосадочной жидкости прибавляют 0,5 мл бидистиллированной воды, 0,1 мл 85%-ного раствора фосфорной кислоты (орто), 0,8 мл 1%-ного раствора а,сс'-дипири-дила и 0,1 мл 3%-ного раствора FeCl3. Содержимое пробирки после добавления каждого реактива тщательно перемешивают и оставляют на 30 мин для развития окраски. Окраска стабильна в течение 1 сут.
По истечении 30 мин пробы центрифугируют при 2000 мин-1 и колориметрируют на ФЭКе при длине волны 525 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 5 мм против контрольной пробы (вместо надосадочной жидкости берут дистиллированную воду, а затем поступают так же, как с опытной пробой).
Расчет содержания витамина С ведут с помощью калибровочного графика. 33,3 г аскорбиновой кислоты растворяют в 100 мл 5%-ного раствора ТХУ. 10 мл этого раствора вносят в мерную колбу на 100 мл и доливают до метки 5%-ный раствор ТХУ. В 6 мерных колб на 100 мл вносят последовательно 4, 6, 8, 10, 20 и 30 мл стандартного раствора и доводят объем до метки дистиллированной водой. По 1,5 мл раствора из каждой колбочки вносят в центрифужные пробирки, прибавляют по 0,1 мл 85%-ной фосфорной кислоты (орто), 0,8 мл 1%-ного раствора а,сс'-дипиридила и 0,1 мл 3%-ного раствора FeCl3, перемешивают, ставят на 30 мин для проявления окраски.
199
Перед крлориметрированием пробы центрифугируют 5 мин при 2000 мин . Полученные результаты изображают графически на миллиметровой бумаге.
Примечания. 1. Стандартные растворы аскорбиновой кислоты нестойки. Их готовят непосредственно перед определением. 2. Содержание витамина С в плазме крови при ее хранении снижается. 3. Определять количество витамина С необходимо в свежей плазме, отделенной от форменных элементов в течение 4 ч после отбора проб крови.
Источники: 44, 60.
Клиническое значение. Аскорбиновая кислота участвует в различных обменных реакциях: гидроксилирование проли-на при синтезе коллагена: превращение 3,4-диоксифенилэтилами-на в норадреналин; превращение кортикостероидов и трансферина и т. д. Всасывается она в желудочно-кишечном тракте, главным образом в тонком кишечнике. Уровень аскорбиновой кислоты в сыворотке крови животных колеблется в пределах 0,2—1,5 мг%. В плазме крови он несколько выше, чем в сыворотке. Снижение содержания в сыворотке крови до 0,3—0,4 мг% и ниже сопровождается клиническими симптомами гиповитаминоза.
Определение витамина B12 в биологических жидкостях и тканях. Количественное определение витамина Bj2 (кобаламин, цианкоба-ламин) в настоящее время проводится химическими и микробиологическими методами. Наибольшей точностью и специфичностью обладает микробиологический метод.
Принцип. Микробиологический метод количественного определения витамина Br2 с культурой Escherichia coli 113-3 основан на определении интенсивности роста микроорганизмов путем измерения мутности их размножением. По данным интенсивности роста в исследуемом материале строится стандартная кривая, по которой находят искомое количество витамина.
Реактивы: 1) культура Escherichia coli 113-3. Ее выращивают на агаровых косяках и хранят в холодильнике. Раз в месяц культуру пересевают на свежую агаровую среду и после пересева выдерживают 24 ч в термостате при 37 °С;
2) агаровая среда. Состав агаровой среды в расчете на 100 мл: а) казеиновый кислотный 10%-ный гидролизат — 6 мл; б) калия фосфат двузамещенный (K2HPO4) — 20 мг; в) железа сульфат (FeSO4 •7H2O) - 0,5 мг. 100 мг FeSO4 •7H2O разводят в 100 мл дистиллированной воды, отсюда берут 0,5 мл; г) магния сульфат (MgSO4 • 7H2O) — 20 мг. Указанные компоненты растворяют последовательно в одной порции воды; д) L-аспарагин — 20 мл (L-ac-парагин растворяют отдельно с прибавлением нескольких капель 1 н. раствора HCl при слабом подогревании и затем прибавляют к вышеуказанному раствору. pH раствора доводят 1 н. раствором NaOH до 7,0. Затем добавляют); е) глицерин (10 г глицерина до-
