Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Оборудование: ФЭК или спектрофотометр; водяная баня; термостат; колбы мерные; пипетки; пробирки.
Ход определения. В пробирки (высотой 15 см) с 0,01 мл сыворотки крови добавляют 0,5 мл концентрированной серной
137
кислоты. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и ставят в кипящую водяную баню или термостат при температуре 130 0C на 20 мин. Водяная баня должна быть заполнена водой не ниже уровня жидкости в пробирках, поставленных в нее. Используемые для анализа пробирки и другую посуду моют отдельно, тщательно ополаскивают дистиллированной водой и спиртом. Через 20 мин пробирки охлаждают под водопроводной водой, приливают 1,5 мл сульфофосфованилинового реактива, тщательно встряхивают и выдерживают в темноте при комнатной температуре 45 мин. Содержимое пробирки постепенно меняет желтый цвет на красный, который стабильно удерживается до 18 ч.
Через 1 ч определяют оптическую плотность на ФЭКе или спектрофотометре при зеленом фильтре (500—560 нм) в кювете с толщиной слоя 0,5—1 см против холостой пробы. Холостую пробу готовят так же, как и опытную, но вместо сыворотки берут 0,01 мл воды. Если концентрация липидов низкая и недостаточно улавливается на ФЭКе, то для исследования берут двойную дозу сыворотки (0,02 мл).
Расчет ведут по калибровочному графику. Для его построения из стандартного раствора триолеина готовят рабочие калибровочные растворы (табл. 20).
20. Приготовление рабочих растворов для построения калибровочного графика
N° пробирки
1 2 3 4 5 6
Стандартный раствор триолеииа, мл
0,17 0,33 0,50 0,67 0,83 1,00
Хлороформ, мл
0,83 0,67 0,50 0,33 0,17
Концентрация общих липидов, мг%
200 400 600 800 1000 1200
Берут по 0,01 мл каждого разведения калибровочного раствора и выполняют все операции, как с опытными пробами (обязательно выдерживают в водяной бане точно так же, как и пробирки с исследуемой сывороткой). В противном случае цветная реакция с сульфофосфованилиновым реактивом не наступает или будет очень слабой, нехарактерной. Холостую пробу с дистиллированной водой можно не выдерживать в водяной бане.
На основании полученных данных строят калибровочный график.
Прямолинейная зависимость между концентрацией общих липидов и оптической плотностью сохраняется до 1200 мг%. Поэтому при большей концентрации сыворотку крови разводят физраствором и результаты умножают на разведение.
Для определения этим методом содержания общих липидов в тканях животных необходимо свежую или замороженную ткань
138
подвергнуть деемолизу в 33%-ном растворе калия гидроксида* В пробирку помещают 200 или 300 мг ткани, прибавляют 3 мл 33%-ного калия гидроксида и выдерживают на кипящей водяной бане 60—120 мин, периодически встряхивая. Содержимое пробирок доводят дистиллированной водой до 5 мл и тщательно перемешивают. Из этого содержимого берут 0,2 мл в другую пробирку, приливают 1 мл серной кислоты и кипятят в бане или выдерживают в термостате при температуре 130 °С в течение 20 мин. После охлаждения приливают 2 мл сульфофосфованилиновой смеси и дальнейшие операции проводят так же, как описано выше с сывороткой крови. Однако в этом случае при исследовании на ФЭКе удобнее пользоваться кюветами с толщиной слоя 0,5 см. Сравнение определения концентрации общих липидов в известных стандартных растворах и в пробах, проводимое различными методами, показало высокую точность и воспроизводимость результатов. Источник: 6, 29, 57.
3.3.6.2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КЛАССОВ ЛИПИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ
Для количественного определения отдельных классов липидов используют готовый экстракт липидов, выделенный по методу Фолча, или берут пробы натуральных биосубстратов и поступают, как описано ниже.
Определение содержания фосфолипидов (по Бартлетту—Ушеру). Принцип. Метод основан на минерализации липидов с помощью хлорной кислоты. Неорганический фосфор, взаимодействуя с аммония молибдатом, образует фосфомолибденовую кислоту, которую восстанавливают эйконогеном и натрия пиросульфитом в молибденовую синь. По степени окраски, определяемой колориметрически, вычисляют количество неорганического фосфора, содержащегося в фосфолипидах. Фосфолипиды стабильны в сыворотке или в плазме крови в течение 1 дня при комнатной температуре, 1 нед при хранении в холодильнике.
Реактивы: экстракционная смесь Фолча (хлороформ-метанол, 2 : 1);
72 %-ная хлорная кислота (HClO4) или смесь равных объемов 60%-ной хлорной и 95—97%-ной серной кислот (плотность 1,84);
5%-ный раствор аммония молибдата [NH4)^ • MOyO24 • H2O];
сульфит-сульфоновый реактив. 13 г пиросульфита натрия (Na2S2Os), 0,5 г сульфита натрия (Na2SOi) и 0,25 г эйконогена (1-амино-2-нафтол-4-сульфоновая кислота) растворяют в 100 мл дистиллированной воды (перегнанной в стеклянном дистилляторе) при постоянном встряхивании в течение 1 ч. Фильтруют через бумажный фильтр (лучше через синтетический № 4) и хранят в темной склянке. Реактив готовят еженедельно.
Оборудование: ФЭК или спектрофотометр; песчаная баня; водяная баня; колбочки плоскодонные на 50 и 100 мл; ворон-
