Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
133
3.3.6.1. ВЫДЕЛ ЕНИЕЛИПИДОВ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ СУБСТРАТОВ
В основе выделения липидов лежат такие операции, как экстракция, очистка их от нелипидных компонентов, концентрация и определение суммарного выхода липидов методом взвешивания на аналитических весах. Среди известных в настоящее время методов выделения липидов из биологических материалов в лабораторной практике наиболее распространен метод экстракции хлоро-форм-метаноловой смесью; реже прибегают к экстракции спирто-во-эфирной смесью.
Метод экстракции липидов хлороформ-метаноловой смесью (по Фолчу). Принцип. Метод заключается в разрушении липид-но-белковых связей полярными растворителями (в данном случае метанолом), что облегчает последующее экстрагирование липидов неполярными растворителями (хлороформом, диэтиловым или петролейным эфиром). В данном случае полярные и неполярные растворители представлены в виде одной смеси. Метод пригоден для извлечения липидов из любых тканей животного и растительного происхождения. В настоящее время считается универсальным. Обязательное требование данного метода — соблюдение соотношения субстрата и растворителя 1 : 20.
Реактивы: хлороформ. Из хлороформа необходимо удалить фосген, который реагирует с окси- и аминогруппами липидов. Свежий продажный хлороформ достаточно перегнать и хранить в темной бутылке с добавлением 1 % метанола (или этанола), который препятствует образованию фосгена;
метанол освобождают от альдегидов перегонкой над гранулированным калия гидроксидом. Перегнанный метанол хранят в темной бутылке 1—2 мес;
смесь хлороформ-метанола в соотношении 2 : 1 по объему (смесь 1);
смесь растворителей верхней фазы, содержащая минеральные соли (смесь 2): хлороформ-метанол-водный раствор соли в соотношении 3 : 48 : 47 по объему. В качестве солей могут быть использованы KCl (0,75 %), NaCl (0,58 %) или CaCl2 (0,04 %);
антиоксидант бутилокситолуол (БОТ, ионол).
Оборудование: пробирки обычные и с притертыми пробками вместимостью 10, 20 и 50 мл; цилиндры мерные с притертыми пробками вместимостью 25, 50 и 100 мл; конические колбочки с плоским дном обычные и с притертыми пробками на 50 и 100 мл; пипетки с делениями разных объемов; гомогенизатор; водоструйный насос; роторный испаритель; аналитические весы.
Ход определения. В пробирку или колбу наливают необходимое количество смеси 1, из пипетки вносят необходимый объем сыворотки (плазмы) крови или молока (например, 40 мл хлороформ-метаноловой смеси и 2 мл сыворотки в соотношении 1 : 20). Чтобы избежать окисления липидов, к пробам добавляют антиоксидант бутилокситолуол (БОТ), который вносят с метано-
134
лом в количестве 0,1 % от количества липидов. Смесь тщательно перемешивают стеклянной палочкой или покачиванием колбы и оставляют стоять или подогревают на водяной бане при 40—45 °С 2—3 мин, затем фильтруют через обезжиренный бумажный или стеклянный фильтр в мерный цилиндр на 50 мл с притертой пробкой.
Желток яйца вносят в предварительно взвешенную колбочку, взвешивают и заливают смесью 1.
Печень или мышечную ткань отвешивают, помещают в стакан гомогенизатора, добавляют такое же количество физраствора и гомогенизируют 2—3 мин. Затем отвешивают необходимое количество (2—6 г) гомогената в плоскодонную колбочку, заливают 20 частями смеси 1, тщательно перемешивают стеклянной палочкой, оставляют стоять в течение 1 ч или подогревают на водяной бане в течение 5—10 мин и потом фильтруют в мерный цилиндр.
Для экстракции липидов из кормов или сухих образцов животных тканей их измельчают, заливают смесью 1, колбочки закрывают пробкой и оставляют для экстракции на 18—24 ч (с периодическим перемешиванием) или встряхивают на шуттель-аппарате в течение 1,5—2 ч. Содержимое подогревают при 45—50 °С 5—10 мин и фильтруют.
Для удаления нелипидных соединений из экстракта к последнему добавляют 1/5 объема воды (это соотношение следует строго соблюдать, так как в противном случае расслоение смеси на две фазы не произойдет). Цилиндр закрывают притертой пробкой, энергично встряхивают до образования молокообразной взвеси и оставляют стоять на ночь для расслоения или содержимое переносят в пробирки и центрифугируют.
Верхний водно-спиртовой слой (~ 40 %), содержащий нелипид-ные вещества, удаляют микробиологической пипеткой, присоединенной к водоструйному насосу или к шприцу. При этом нельзя затрагивать пограничную (липопротеидную) пленку. Если она содержит много нелипидных соединений (рыхлая, белого цвета), то ее следует отмыть. Для этого по стенке цилиндра пипеткой наслаивают 1—2 мл смеси 2. Цилиндр осторожно поворачивают вокруг своей оси, и смесь отсасывают. При необходимости эту операцию повторяют 2—3 раза. Утонченную пленку растворяют каплями метанола.
В нижнем хлороформном слое (~ 60 %) концентрируются липиды. Для определения количества экстрагированных из исследуемой пробы липидов можно использовать два метода.
1. Исходный экстракт переносят в предварительно обезжиренную и взвешенную колбу со шлифом, присоединяют к роторному испарителю и отгоняют хлороформ под вакуумом (присоединяя к водоструйному насосу) с подогревом до 40 °С. Эта операция занимает 5—7 мин.
