Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
124
Одновременно ставят холостой опыт, в котором вместо безбелкового фильтрата применяют 5%-ный раствор трихлоруксусной кислоты, и калибровочные пробы, в которые берут растворы ТХУ, содержащие в 0,2 мл 2—20 нмоль молочной кислоты или молочнокислого лития. Их обрабатывают так же, как опытные. Окраска калибровочной пробы, в которой взято 2 нмоля молочной кислоты, соответствует пробе с содержанием 0,5 ммоль/л; соответственно окраска пробы, содержащей 20 нмоль, соответствует концентрации 5 ммоль/л.
Источник: 43.
Примечание. Метод определения молочной кислоты по Баркеру и Саммерсону изложен в книге «Клиническая лабораторная диагностика в ветеринарии»: Справочник / И. П. Кондрахин, Н. В. Курилов, А. Г. Малахов и др. — M.: Агропромиздат, 1985. — С. 88—90.
Клиническое значение. Молочная кислота образуется при распаде гликогена и глюкозы, ее источником также служит пирувит. В норме содержание молочной кислоты у животных колеблется в пределах 0,295—0,760 ммоль/л (см. приложение 5).
Повышение содержания молочной кислоты (гиперлактатемия) отмечается при ацидозе рубца, поедании животными большого количества свеклы, зеленой массы кукурузы молочно-восковой спелости, зерновых злаковых, содержащих много крахмала. Бывает при миоглобинурии, диабете, эндемической остеодистрофии бычков, интенсивном их выращивании и откорме, когда болезнь сопровождается ацидозом рубца и всасыванием в кровь большого количества молочной кислоты. Повышение концентрации лактата в крови может быть обусловлено поражением печени, кислородной недостаточностью (гипоксия), чрезмерной физической нагрузкой, местным нарушением кровообращения.
Метод неферментативного определения лактата и пирувата в одной пробе крови. Пр и н ц и п. В основу метода определения лактата положена способность молочной кислоты превращаться в ацетоальдегид, который дает с гидрохиноном красно-коричневое окрашивание. В щелочной среде пируват с п-диметиламинбен-зальдегида (п-ДБА) образует комплекс желтого цвета.
Условия взятия образца крови, хранения и исследования такие же, как и при определении лактата.
Реактивы: 10%-ный раствор Н2РО3. Хранят не более 3 дней;
25%-ный раствор CuSO4 • 5НгО;
10%-ный раствор CuSO4 • 5Н2О;
Ca(OH)2 в порошке (ч. д. а.);
концентрированная H2S04;
20%-ный спиртовой раствор гидрохинона;
раствор п-диметиламинбензальдегида (п-ДБА): 500 г п-ДБА в 60 мл метилсульфоксида, дистиллированная вода до 100 мл;
25%-ный раствор NaOH.
125
Оборудование: водяные бани на 37 0C и 100 °С; центрифуга ОПН-8; спектрофотометр СФ-46; центрифужные пробирки; пробирки с притертыми пробками; пипетки.
Ход определения. В центрифужную пробирку вносят 6 мл дистиллированной воды и 1 мл взятой крови, 1 мл 10%-ного раствора Н2РО3, хорошо встряхивают и оставляют на 2 мин для осаждения белков. Центрифугируют 5 мин при 2000—3000 мин Прозрачную надосадочную жидкость переносят в чистую центрифужную пробирку, приливают 1 мл 25%-ного раствора CUSO4 и вносят 0,5 г Са(ОН)2, тонко растертого до порошка. Стеклянной палочкой перемешивают пробы, пока голубая окраска не перейдет в синюю. Через 30 мин центрифугируют пробу 10 мин при 2000—3000 мин-1. Полученный безбелковый центрифугат переносят в градуированную пробирку для определения коэффициента К измерения объема анализируемого раствора:
K = V/v,
где V — общий объем анализируемого раствора (кровь, вода, осадители белков и углеводов), мл; v — объем безбелкового и безуглеводного центрифугата, мл.
Для определения пирувата (P) в центрифужную пробирку вносят 1 мл анализируемого раствора (в контроль — 1 мл воды), 3 мл реактива п-ДБА и 1 мл 25%-ного раствора NaOH. Тщательно перемешивают реакционную смесь и помещают в водяную баню при 37 °С на 45 мин.
Во время термостатирования смеси с пируватом параллельно определяют содержание лактата. Для этого в центрифужную пробирку с притертой пробкой вносят 1 мл прозрачного центрифугата
(в контроль — 1 мл воды), добавляют по 0,1 мл 10%-ного раствора CuSO4 и осторожно по стенке приливают по 4 мл концентрированной H2SO4, хорошо закрывают пробкой во избежание испарения образовавшегося в результате реакции ацетальдегида. Смесь помещают в кипящую водяную баню на 1,5 мин. После кипячения и охлаждения вносят 0,1 мл спиртового раствора гидрохинона, перемешивают, повторно помещают в кипящую водяную баню на 15 мин и охлаждают. Охлажденный раствор колориметрируют при длине волны 430 нм против контроля. Содержание лактата рассчитывают по калибровочной кривой с учетом коэффициента К (рис. 2).
% Концентрация, ммоль/л
* 0,5 1 1,5 2,0
Концентрация, мкмоль/л
Рис. 2. Калибровочные кривые для определения лактата и пирувата:
По оси абсцисс — концентрация (ммоль/л) лактата (сплошная линия), концентрация (мкмоль/л) пирувата (пунктирная линия); по оси ординат — оптическая плотность, относительные единицы
126
По истечении 45 мин термостатирования реакционную смесь с пируватом центрифугируют при 2000—3000 мин-1 и осторожно переносят надосадочную жидкость в спектрофотометрические кюветы для определения оптической плотности анализируемого раствора (при 420 нм) против контроля. Концентрацию пирувата рассчитывают по калибровочной кривой с учетом коэффициента К.
