Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Калибровочную пробу ставят так же, как опытную, но вместо безбелкового фильтрата крови берут 0,1 мл раствора глюкозы с концентрацией 50 или 100 мг%, 0,1 мл 20 %-ного раствора ТХУ, 0,3 мл дистиллированной воды и 4,5 мл орто-толуидинового реактива.
Расчет ведут по формуле
Qm = •50 (или 10°).
Ек
где C0n — концентрация глюкозы в пробе, мг%; E0n — оптическая плотность пробы; Ек — оптическая плотность калибровочного раствора; 50 (или 100) — коэффициент для пересчета в мг% (калибровочный раствор содержит 50 или 100 мг% глюкозы).
Для выражения глюкозы в ммоль/л коэффициентом при 50 мг%-ном растворе будет 2,777, а при 100 мг%-ном — 5,555. При переводе мг% в ммоль/л полученную величину умножают на 0,0555.
Определение глюкозы в моче. После проведения качественной пробы на содержание глюкозы в моче в зависимости от характера реакции разводят мочу в 2—10 раз. 0,1 мл разведенной мочи смешивают с 4,5 мл орто-толуидинового реактива и далее обрабатывают и измеряют, как указано для крови. При расчете результатов соответственно надо учитывать разведение мочи.
Примечания. 1. Построение калибровочного графика не рекомендуется, так как интенсивность окраски проб зависит от условий опыта. Поэтому правильнее обрабатывать калибровочные пробы одновремен-
118
но с опытными и вести расчет по приведенной выше формуле. 2. При исследовании крови свиней и лошадей целесообразно готовить стандартный раствор с содержанием 100 мг% глюкозы. В этом случае коэффициент для пересчета будет не 50, а 100. 3. Для снижения скорости гликолиза целесообразно кроме антикоагулянта добавлять фтористый натрий в количестве 2,5 мг/мл. В этом случае осаждение крови ТХУ не требуется и для анализа берут 0,1 мл стабилизированной цельной крови. Источник: 52.
Изложенный метод определения глюкозы в биологических жидкостях по цветной реакции с орто-толуидином положен в основу наборов реактивов, реализуемых различными фирмами. В частности, в состав набора реактивов фирмы ЧНПТ «Филист диагностика» (Украина, Днепропетровск) входит раствор трихлор-уксусной кислоты (30 %); орто-толуидиновый реактив (орто-толу-идин, тиомочевина, уксусная кислота); калибровочный раствор глюкозы (5000 мг/л, 27,75 ммоль/л). К наборам заводского приготовления прилагаются соответствующие инструкции.
Определение глюкозы в безбелковом фильтрате крови по Сомод-жи. Принцип. Метод основан на окислении глюкозы в щелочной среде при кипячении с меди сульфатом. При йодометри-ческом определении образовавшаяся закись меди окисляется йодом. Последний освобождается подкислением определенного количества йодноватисто-кислого калия и калия йодид, а оставшийся свободный йод оттитровывается гипосульфитом.
Реактивы: 5 %-ный раствор цинка сульфата. 5 г цинка сульфата 7-водного растворяют в 95 мл дистиллированной воды;
0,3 моль/л раствор натрия гидроксида. 12 г натрия гидроксида (ч. д. а. или х. ч.) растворяют в 700 мл дистиллированной воды, охлаждают и доводят водой до 1 л. Первый и второй реактивы должны нейтрализовать друг друга. Последнее проверяют медленным титрованием с индикатором фенолфталеином;
реактив Сомоджи: меди сульфат 5-водный (ч. д. а., х. ч.) 8 г; натрия карбонат безводный (ч. д. а., х. ч.) 30 г; калий-натрий виннокислый 4-водный (сегнетова соль) (ч. д. а.) 30 г; калия йодид (ч. д. а., х. ч.) 5 г; натрия сульфат безводный (ч. д. а., х. ч.) 180 г; раствор 1 моль/л натрия гидроксида (х. ч.) 40 мл; калий йоднова-тистокислый 1 моль/л раствор (35,67 г KIO3, ч. д. а., х. ч. на 1 л) 5—10 мл.
Приготовление реактива. Натрид карбонат и сегнетову соль растворяют в 200 мл горячей воды, добавляют раствор натрия гидроксида и меди сульфат, перемешивают, после чего кипятят для удаления CO2. Натрид сульфат растворяют в 500 мл горячей дистиллированной воды и нагревают до кипения. Оба рас-
119
твора смешивают и добавляют калий йодистый, предварительно растворенный в малом объеме воды. Затем вливают раствор калия йодноватистокислого и после охлаждения доливают водой в мерной колбе до 1 л. Через несколько дней раствор фильтруют. Реактив рекомендуется держать при комнатной температуре в склянке из темного стекла. Перед употреблением его необходимо немного подогреть и растворить осадок. Приготовленный реактив титруют 0,005 н. раствором гипосульфита. На 1 мл реактива Сомоджи должно пойти 1 мл 0,005 н. раствора гипосульфита. Титр раствора Сомоджи доводят раствором калия йодноватистокислого 1 моль/л;
2 н. (1 моль/л) раствор серной кислоты. 56 мл концентрированной серной кислоты (плотность 1,84) доводят водой в мерной колбе до 1 л;
0,005 н. раствор натрия тиосульфита (гипосульфита) 5-водного. Готовят перед анализом из 0,1 н. раствора, приготовленного из стандарт-титра (фиксанала);
1%-ный раствор крахмала, приготовленного в насыщенном растворе натрия хлорида;
1%-ный спиртовый раствор фенолфталеина;
натрий фторид.
Оборудование: сахарные пробирки; водяная баня; микробюретки на 5 мл; колбы из термостойкого стекла на 500 и 1000 мл; термос на 3—5 л.
Ход определения. Для исследования используют цельную гепаринизированную кровь, стабилизированную фтористым натрием из расчета 5—10 мг/мл. Кровь необходимо по возможности быстрее доставить в лабораторию в термосе со льдом, где получают безбелковый фильтрат: к 1 части крови добавляют 5 частей дистиллированной воды, 2 части 0,3 моль/л раствора натрия гидроксида и 2 части 5%-ного раствора цинка сульфата (например, 5 мл крови + 25 мл воды + 10 мл раствора натрия гидроксида + 10 мл 5 %-ного раствора цинка сульфата). Тщательно перемешивают и через 30 мин фильтруют или центрифугируют при 3000 мин-1 в течение 10 мин. Фильтрат (центрифугат) сливают в пробирку и закрывают пробкой. Хранить можно в холодильнике не более 2—3 дней. Этот фильтрат можно использовать для определения кетоновых тел.
