Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кондрахин И.П. -> "Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики" -> 52

Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.

Кондрахин И.П., Архипов А.В., Левченко В.И., Таланов Г.А., Фролова Л.А., Новиков В.Э. Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики: Справочник. Под редакцией Сайтаниди В.Н. — М.: Колос, 2004. — 520 c.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка): metodvetkllabdia2004.djvu
Предыдущая << 1 .. 46 47 48 49 50 51 < 52 > 53 54 55 56 57 58 .. 246 >> Следующая


1,75

Раствор натрия хлорида

1,75
0,25

Диазосмесь
0,25
0,25


Для определения связанного билирубина измерение на фото-электроколориметре проводят через 5—10 мин после добавления диазосмеси, так как при длительном стоянии в реакцию вступает несвязанный билирубин. Для определения общего билирубина пробу для развития окраски оставляют на 20 мин, после чего измеряют на ФЭКе. В дальнейшем окраска не изменяется.

Измерение проводят при длине волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против воды. Из показателей, полученных при колориметрировании общего и связанного билирубина, вычитают показатель контроля.

Расчет ведут по калибровочному графику. Находят содержание общего и связанного билирубина. Для определения уровня непрямого билирубина вычитают из показателя общего его содержания показатель прямого билирубина.

Способ 1. Калибровочный график строят по способу Шелон-га—Венде с использованием стабилизирующего свойства белка сыворотки крови.

Реактивы для построения калибровочного графика. 1. Основной раствор билирубина. Препараты кристаллического билирубина отличаются по своим свойствам. Не каждый билирубин может быть использован для построения калибровочного графика. Допустим лишь тот билирубин, 1 мг%-ный раствор которого при растворении в хлороформе (для наркоза) при 25 °С дает на спектрофотометре абсорбцию от 1,01 до 1,07 при длине волны 453 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

В колбе вместимостью 50 мл растворяют 40 мг билирубина (имеющийся в продаже билирубин является непрямореагирую-щим) в 30—35 мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия (10,6 г безводного Иа2СОз доводят до 1 л дистиллированной водой) и хорошо перемешивают, не допуская образования пузырьков. Доводят до 50 мл 0,1 моль/л раствором ЫагСОз и несколько раз перемеши-

110

вают. Раствор стоек только в течение 10 мин от начала приготовления. В дальнейшем билирубин окисляется.

2. Рабочий раствор билирубина. К 13,9 мл свежей негемолизи-рованной сыворотки крови добавляют 2 мл свежеприготовленного раствора билирубина и 0,1 мл (4 моль/л) раствора уксусной кислоты (25 мл ледяной уксусной кислоты доводят до 100 мл дистиллированной водой). Хорошо перемешивают. При этом выделяются пузырьки углекислого газа. Рабочий раствор стоек в течение нескольких дней. Он содержит на 10 мг% билирубина больше, чем сыворотка, взятая для приготовления раствора. Чтобы исключить при расчетах количество билирубина, содержащегося в этой сыворотке крови, при измерении на ФЭКе из величины экстинкции калибровочных проб вычитают величины экстинкции соответствующих разведений компенсационной жидкости.

Для приготовления компенсационной жидкости смешивают 13,9 мл той же сыворотки, которая использовалась для приготовления калибровочного раствора билирубина, 2 мг 0,1 моль/л раствора КагСОз и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты.

Для построения калибровочного графика готовят ряд разведений с различным содержанием билирубина (табл. 17).

17. Разведения билирубина для построения калибровочного графика

N° пробирки
Рабочий раствор билирубина, мл
0,9%-ный раствор натрия хлорида, мл
Количество билирубина в пробе
Концентрация билирубина в сыворотке крови, мкмоль/л

мг
мкмоль/л

1
0,05
0,45
0,005
0,00855
17,1

2
ОД
0,4
0,01
0,0171
34,2

3
0,15
0,35
0,015
0,02565
51,3

4
0,2
0,3
0,02
0,0342
68,4

5
0,25
0,25
0,025
0,04275
85,5

К полученным разведениям прибавляют по 1,75 мл кофеинового реактива и по 0,25 мл диазосмеси. При появлении помутнения можно добавить по 3 капли 30%-ного раствора натрия гидроксида. Измерение проводят при тех же условиях, что и в опытных пробах, через 20 мин. Из компенсационной жидкости готовят разведения аналогично калибровочным (см. табл. 17) и далее обрабатывают их так же, как калибровочные пробы.

Способ 2. Калибровочный график строят по готовым наборам реактивов, выпускаемых отечественными и зарубежными фирмами. Калибровочная кривая линейна до 170 мкмоль/л.

Подбор реактивов в коммерческих наборах основан также на диазореакции, положенной в основу метода Ендрассика—Клеггор-на—Грофа.

Ill

Примечание. Сыворотка или плазма крови должны быть свежими, свободными от гемолиза, прозрачными. Плазму или сыворотку крови хранят не более двух дней при температуре 4—25 °С. Исследования проводят незамедлительно. Образцы крови защищают от света.

Источник: 43.

Определение билирубина в сыворотке крови животных по методу Ендрассика—Клеггорна—Грофа в модификации В. И. Левченко и В. В. Влизло. Принцип метода и реактивы: условия анализов те же, что в предыдущей методике, принятой в качестве унифицированной.

Ход определения. В4 пробирки вносят по 0,5 мл разведенной в 2 раза сыворотки крови. Первая пробирка является контролем для определения общего билирубина. В нее вносят 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида и 1,75 мл кофеинового реактива. Во второй пробирке определяют содержание общего билирубина: вносят 0,25 мл диазореактива и 1,75 мл кофеинового реактива. Третья пробирка — контроль для связанного билирубина. В нее вносят 2 мл изотонического (0,9%-ного, 154 ммоль/л) раствора натрия хлорида. В четвертую пробирку вносят 1,75 мл изотонического раствора натрия хлорида и 0,25 мл диазосмеси и определяют связанный билирубин (табл. 18).
Предыдущая << 1 .. 46 47 48 49 50 51 < 52 > 53 54 55 56 57 58 .. 246 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed