Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Примечания. 1. Длительное кипячение (более 10 мин) предметных стекол и кипячение их в алюминиевой посуде приводит к помутнению стекол. 2. Полноту отмывки от щелочных средств проверяют качественной реакцией с 0,1%-ным спиртовым раствором фенолфталеина, путем нанесения 2—3 капель на чистое стекло. Появление розового окрашивания свидетельствует о плохой промывке стекол. Приготовление мазков. Мазки крови готовят на предварительно подготовленных обезжиренных предметных стеклах. Берут за ребра (а не за поверхность) предметное стекло и, отступая 1,5—2 см от узкого конца, наносят на него небольшую каплю крови. Шлифовальным стеклом, которое несколько уже, чем предметное, на которое нанесена капля крови, размазывают последнюю. Для этого шлифовальное стекло узким краем ставят под углом 45° слева от капли, слегка подвигают его вправо, чтобы провести с ней соприкосновение, выжидают, пока капля расплывется по всему ребру, и легким быстрым движением ведут стекло справа налево, пока капля будет исчерпана.
При медленном размазывании ухудшается равномерность распределения форменных элементов в мазке. При нажимании стеклом на стекло многие клетки повреждаются. Если угол между стеклами меньше 45°, то большее количество клеток скапливается в конце мазка. Величина капли должна быть соразмерна тому, чтобы весь мазок помещался на стекле, не доходя 1—1,5 см до его конца. Мазок должен иметь желтоватый цвет. Густо-розоватые и красноватые мазки не пригодны для счета, так как лейкоциты в них деформированы, а эритроциты лежат один на другом. Если была взята слишком большая капля, то после того как она распределилась по ребру шлифованного стекла, последнее приподнимают, переносят на несколько миллиметров влево, вновь ставят на предметное стекло и отсюда начинают делать мазок. Мазок тотчас сушат на воздухе. На сухом мазке по его середине иглой пишут номер или кличку животного, при необходимости и дату взятия крови.
Фиксация мазков. Фиксирующая жидкость вызывает коагуляцию белка и прикрепляет клетку к стеклу. Фиксация придает форменным элементам крови стойкость по отношению к содержащейся в краске воде и препятствует деформации эритроцитов и лейкоцитов.
Реактивы: метиловый спирт (х. ч.) или эозин метиленовый синий по Май-Грюнвальду (раствор), или этиловый спирт 96%-ный.
Оборудование: штатив для сушки мазков; пинцет; широкогорлая банка с притертой пробкой или крышкой.
Ход определения. Высохшие на воздухе мазки опускают в широкогорлую банку с крышкой, выдерживают в фиксаторе
53
5—10 мин, затем извлекают пинцетом и высушивают на воздухе. В этиловом спирте мазки выдерживают не менее 35 мин.
Для фиксации и последующей обработки необходимо отбирать правильно приготовленные тонкие мазки (мазок должен быть желтого цвета, отступать от края широких сторон предметного стекла на 1—3 мм и заканчиваться «метелочкой», не доходя 1,5—2 см до левого узкого края).
Окраска мазков. Оборудование: контейнеры для окраски мазков с кюветами или «рельсы» стеклянные с эмалированными лотками; пинцет; цилиндры или стаканы градуированные; палочки стеклянные; стаканчики химические; бутылки с притертыми пробками.
В строго нейтральной среде структурные элементы клеток крови в азур-эозиновой смеси окрашиваются в различные цвета: щелочные компоненты клетки (цитоплазма) — эозином в розово-красный цвет; кислые (РНК в ядрышках и цитоплазме, ДНК в ядре) — основными красителями в голубовато-синие цвета. Для приготовления красителей и смывания их с мазков используют воду нейтральной реакции. Вода кислой реакции ослабляет действие щелочного элемента красителя (азура II), вследствие чего лейкоциты плохо окрашиваются. Мазки имеют красный цвет за счет красной окраски эритроцитов и ядер лейкоцитов. Вода щелочной реакции ослабляет действие кислого компонента красителя (эозина), поэтому эритроциты окрашиваются в серовато-синий цвет, а ядра лейкоцитов — в очень темные цвета. Для подщелачивания и доведения реакции воды до нейтральной к ней по каплям прибавляют 1%-ный раствор натрия двууглекислого. Щелочную воду нейтрализуют 1%-ным раствором уксусной кислоты. Можно брать дистиллированную и водопроводную воду в различных сочетаниях.
Реакцию воды можно определить с помощью pH-метра или гематоксилина. При использовании гематоксилина к 10 мл дистиллированной воды прибавляют 2—3 капли свежеприготовленного спиртового раствора гематоксилина. Вода нейтральной реакции окрашивается в бледно-фиолетовый цвет не ранее чем через 1 мин и не позднее чем через 5 мин. Если вода окрасилась раньше чем через 1 мин, значит, она щелочная, а если позднее чем через 5 мин, — кислая.
Окраска по Нохту. Реактивы:
1) основные растворы красителей — азур II, 1 г/л (1,0 г азура II растворяют в 1000 мл дистиллированной воды) и эозин калия, 1 г/л (1,0 г эозина калия растворяют в 1000 мл дистиллированной воды). Растворы готовы к употреблению через 14 дней со дня приготовления, хранят их в посуде темного стекла с притертой пробкой при комнатной температуре;
2) фосфатный буфер или смесь Вейзе (pH 7,4—7,5): калия фосфат однозамещенный безводный (KH2PO4) 0,49 г, натрия фосфат
