Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Примечание. Окраска в ячейках может развиваться быстрее или медленнее чем за время, рекомендованное для комнатной температуры, поэтому необходимо визуально наблюдать за развитием окраски для установления оптимального времени инкубации.
После инкубации в каждую ячейку полуавтоматической пипеткой добавляют по 100 мкл стоп-раствора (0,2 M раствор серной кислоты) для остановки цветной реакции. Измеряют оптическую плотность стандартов, контролей и исследуемых образцов на пла-шечном иммуноферментном анализаторе (ридере) в режиме двойного излучения: при X равно 450 нм и 620 нм (не позднее 30 мин после добавления стоп-раствора).
Полученные значения стандартов ПТГ используют для построения стандартной кривой, по которой определяют концентрацию гормона в исследуемых пробах.
Примечание. Все основные характеристики приведены в пг/мл.
Для перевода в SI (нмоль/л) необходимо пг/мл х X 0,11 = нмоль/л.
Клиническое значение. Паратгормон совместно с каль-цитонином и активными метаболитами витамина D регулирует гомеостаз кальция в организме, что осуществляется путем усиления трансмембранного транспорта кальция из кишечника [совместно с 1,25 (OH)2D3], повышения реабсорбции кальция в дистальных отделах почечных канальцев и усиления резорбции костной ткани. При снижении содержания кальция в сыворотке крови по принципу обратной связи увеличивается секреция ПТГ, что, в свою очередь, повышает синтез 1,25(OH)2D3, а последний усиливает резор-
29*
451
бцию костной ткани путем повышения активности остеокластов, всасывание кальция в кишечнике через регуляцию синтеза СаСБ и его реабсорбцию в дистальных канальцах почек (Л. И. Апуховская с соавт., 2003).
В крови клинически здоровых коров перед отелом содержание паратгормона составляет 4,36 ± 0,19 нг/мл, при послеродовой гипокаль-циемии — 1,11 ± 0,12 нг/мл (И. Ф. Ганджаев, 1986). У коров с оптимальным содержанием кальция в сыворотке крови (2,26—2,4 ммоль/л) уровень паратгормона составляет 6,1—59,8 пг/мл (О. Ю. Голуб, 2003).
9.7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАЛЬЦИТОНИНА
В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (DIAGNOSTIC SYSTEM
LABORATORY, США)
Принцип. В основу определения гормона положен принцип энзимсвязанного двушагового сендвичеподобного иммуноанализа. Стандарты, контроли и исследуемые образцы инкубируют в микро-титрационных ячейках, покрытых антикальцитониновыми антителами. После инкубации и отмывания ячейки инкубируют с другими антикальцитониновыми антителами, меченными энзимом перокси-дазы хрена. После вторичной инкубации и промывания ячейки инкубируют с субстратом тетраметилбензидина и добавляют стоп-рас-твор. Определяют степень энзимного оборота субстрата измерением абсорбции на микроплашечном ридере при длине волны 450 и 620 нм. Показатели абсорбции прямо пропорциональны концентрации кальцитонина.
Реактивы: 96 полистириновых микротитрационных ячеек с козьими антикальцитониновыми IgG, иммобилизированными на боковых стенках каждой ячейки;
стандарты кальцитонина (лиофилизированные) — 1 флакон (3,0 мл), обозначенный А, с концентрацией 0 пг/мл; 4 флакона (по 1 мл каждый), обозначенные В—F, с концентрациями 10,0; 50,0; 250,0 и 600 пг/мл кальцитонина в буфере с нертутным консервантом;
контроли кальцитонина (лиофилизированные) — 2 флакона по 1 мл с уровнями I и II, содержащие низкую и высокую концентрации кальцитонина в буфере с нертутным консервантом;
кальцитониновый антител-биотиновый конъюгатный концентрат — 1 флакон содержит 0,4 мл биотинмеченого концентрата кальцитонина в протеиновом буфере с нертутным консервантом. Растворить за 10—15 мин перед использованием в аналитическом буфере;
стрептавидин-энзимный конъюгатный концентрат — 1 темный флакон (0,3 мл) содержит стрептавидин-ХПО концентрат в протеиновом буфере с нертутным консервантом. За 5—10 мин до иссле-
452
дования растворяют 1 часть реагента в 50 частях аналитического буфера D;
аналитический буфер D —1 флакон (22 мл) содержит буфер с нертутным консервантом;
ТМБ-хромогенный раствор — 1 флакон (11 мл) содержит раствор тетраметиленбензидина (ТМБ) в нитратном буфере с перок-сидом водорода;
моющий концентрат I — 1 флакон (100 мл) содержит буферные соли с неионным детергентом. Перед использованием развести в 10 частях бидистиллированной воды;
стоп-раствор — 1 флакон (11 мл) содержит 0,2 M раствор серной кислоты;
деионизированная и бидистиллированная вода. Примечание. Все реагенты и пробы перед исследованием следует привести к комнатной температуре (25 °С) и тщательно перемешать путем аккуратного вращения флаконов. Антикоагулянты — гепарин, ЭДТА (1,5 мл/кг), стабилизированные апротинином (тра-сиполот) из расчета 40 КИЕ/мл (калликреининги-бирующих единиц). В таких условиях кальцитонин в крови стабилен в течение 1 ч при комнатной температуре (Gudor М. и соавт., 1996). Предпочтительна плазма без гемолиза и липемии. После взятия кровь немедленно помещают в воду со льдом и тотчас доставляют в лабораторию или центрифугируют, немедленно сливают плазму и замораживают при минус 20 °С или минус 70 °С. Избегать повторного замораживания и размораживания исследуемых проб. Оборудование: микропланшетный иммуноферментный анализатор, настраиваемый на длину волны 450 нм и перенастраиваемый на 600 или 620 нм; инкубатор-шейкер (встряхиватель) для микропланшет на 500—700 встряхиваний в 1 мин; автоматическое промывающее устройство; полуавтоматические пипетки на 50 и 100 мкл; фильтровальная бумага для просушивания стрипов; миллиметровая бумага для построения стандартной кривой (при отсутствии программного обеспечения).