Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
При уменьшении секреции инсулина происходит повышенный распад аминокислот, усиливается окисление липидов (липолиз) с накоплением свободных жирных кислот, кетоновых тел и холестерола.
У здоровых собак уровень глюкозы в крови составляет 80—120 мг/100 мл (4,4—6,56 ммоль/л). Уровень гликемии выше 200 мг/100 мл (11,1 ммоль/л) считают характерным для сахарного диабета. У сухостойных коров содержание инсулина составляет около 20 мкМЕ/мл (К. Остин, Р. Шорт, 1987), за 60—45 дней до отела - 11,7-67,2 (35,2 ± 3,2) нмоль/л (Г. Г. Харута, 1999).
9.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАРАТИРЕОИДНОГО ГОРМОНА (ПТГ) В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ (DIAGNOSTIC SYSTEM LABORATORY, США)
Принцип. В основе исследования заложен «сендвич-метод», или метод двойных антител. В ячейки, предварительно покрытые ПТГ-антителами, вносят стандарты, контроли, исследуемые пробы и специфические антитела к ПТГ, меченные биотином. При этом образуется комплекс АТ-ПТГ-АТ + биотин. После первой инкубации и промывания ячеек для выявления этого комплекса добавляют иммуноферментный конъюгат, меченный пероксидазой. После второй инкубации и промывания в ячейки добавляют хромогенный раствор (ТМБ), интенсивность окрашивания которого изменяется прямо пропорционально концентрации специфических антител в пробе. Измеряют интенсивность окрашивания при длине волны 450 нм.
Реактивы: 96 полистироловых микротитрационных ячеек, покрытых анти-И-ПТГ;
И-ПТГ стандартный растворитель — 1 флакон (1 мл), обозначенный А, содержит 0 нг/мл И-ПТГ в буферной основе с нертутным консервантом;
И-ПТГ стандарты — 6 флаконов по 0,5 мл (B-G) с концентрациями 10,0, 30,0, 100,0, 250,0, 750,0 и 2000 пг/мл в буферной основе с нертутным консервантом;
И-ПТГ контроли — 2 флакона по 1 мл с уровнями I и II, содержащие низкую и высокою концентрацию И-ПТГ в буферной основе с нертутным консервантом;
29 — 4196
449
И-ПТГ аналитический буфер — 1 флакон (11 мл) содержит фосфатно-буферную основу с нертутным консервантом;
И-ПТГ антител-биотиновый конъюгат — 1 флакон (11 мл) содержит анти-И-ПТГ антитела, конъюгированные с биотином в протеиновом буфере с нертутным консервантом;
стрептавидин-энзимный конъюгатный концентрат — 1 флакон (0,3 мл) содержит стрептавидин-энзимный конъюгат с нертутным консервантом. Развести за 10—15 мин перед использованием в И-ПТГ аналитическом буфере;
ТМБ-хромогенный раствор — 1 флакон (11 мл) содержит раствор тетраметилбензидина (ТМБ) в цитратном буфере с гидроген-пероксидазой;
моющий концентрат — 1 флакон (100 мл) содержит буферные соли с неионизированными детергентами;
стоп-раствор — 1 флакон (11 мл) содержит 0,2 M раствор серной кислоты;
деионизированная или бидистиллированная вода. Примечание. Все реагенты и пробы перед исследованием следует привести к комнатной температуре (25 °С) и тщательно перемешать. Образец крови немедленно помещают в воду со льдом. Сыворотку (плазму) крови сепарируют в охлаждаемой центрифуге (4 0C) и хранят при минус 20 °С и ниже. Не рекомендуется исследовать гемолизированные, икте-ричные и липемичные образцы. Оборудование: микропланшетныйиммуноферментныйанализатор, настраиваемый на длину волны 450 нм и перенастраиваемый на 600 или 620 нм; инкубатор-шейкер (встряхиватель) для микропланшет, настроенный на 500—700 встряхиваний в 1 мин; автоматическое промывающее устройство; полуавтоматические пипетки объемом 50 и 100 мкл; фильтровальная бумага для просушивания стрипов; миллиметровая бумага для построения калибровочного графика (при отсутствии программного обеспечения).
Подготовка реагентов к анализу. 1. Моющий раствор: десятикратно развести моющий концентрат бидистиллированной водой (соотношение 1:9).
2. Стрептавидин-энзимный конъюгатный раствор: стрептавидин-энзимный конъюгатный концентрат развести в соотношении 1:50 конъюгатный растворителем соответственно количеству используемых ячеек. Для полной плашки на 96 проб необходимо 240 мкл концентрата развести в 12 мл конъюгатного растворителя.
Примечание. Антител-стрептавидин-конъюгатный концентрат разводят непосредственно перед исследованием.
3. Микротитрационные ячейки: отобрать для исследования необходимое количество стрипов с ячейками. Неиспользуемые стри-пы поместить во влагонепроницаемый пакет с десикантом.
450
Ход определения. В используемые ячейки вносят по 50 мкл стандартов, контролей и исследуемых проб сыворотки (плазмы) крови (в параллелях). Добавляют в каждую ячейку по 100 мкл антител-биотинового конъюгата. Инкубируют ячейки при комнатной температуре (21—25 °С) в течение 2,5 ч, встряхивая в шейкере микроплат (500—700 встряхиваний в 1 мин). После инкубации при помощи автоматического промывающего устройства сначала проводят аспирацию (откачку содержимого из каждой ячейки), а затем 5 раз промывают каждую лунку 350 мкл моющего раствора. Остатки жидкости в ячейках удаляют, переворачивая и постукивая плашкой по фильтровальной бумаге. Пипеткой вносят в каждую ячейку по 100 мкл стрептавидин-энзимного конъюгатного раствора. Инкубируют плашку со встряхиванием в инкубаторе-шей-кере при комнатной температуре (22—25 °С, 500—700 встряхиваний в 1 мин) 30 мин. После аспирации 5 раз промывают каждую ячейку 350 мкл моющего раствора и осушают плашку с ячейками, переворачивая несколько раз на фильтровальную бумагу. В каждую ячейку вносят по 100 мкл ТМБ-хромогенного раствора и инкубируют в шейкере 10—15 мин (22—25 °С, 500—700 встряхиваний в 1 мин), избегая попадания прямых солнечных лучей.
