Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Оборудование: микропланшетныйиммуноферментныйанализатор Stat Fax-2100, настраиваемый на длину волны 450 нм, 600 или 620 нм; инкубатор-шейкер (встряхиватель) Stat Fax-2200, настраиваемый на 500—700 движений в 1 мин; автоматическое промывающее устройство Stat Fax-2600; полуавтоматические дозаторы объемом 5—50, 50—200 и 200—1000 мкл, наконечники; градуированная лабораторная посуда, полистириновые пробирки; фильтровальная бумага для просушивания стрипов; миллиметровая бумага для построения калибровочного графика (при отсутствии программного обеспечения).
Подготовка реагентов к анализу. 1. Антител-энзимный конъюгатный раствор: в чистой посуде развести инсулиновый антител-энзимный конъюгатный концентрат в аналитическом буфере (1 : 50), исходя из числа используемых ячеек. Если будет использована вся плашка, необходимо 200 мкл антител-энзимного конъ-югатного концентрата инсулина растворить в 10 мл аналитического буфера. Разводить непосредственно перед использованием.
2. Стандарт А восстановленный (0 мкМЕ/мл): во флакон А добавить 1 мл бидистиллированной воды. Хранить до 14 дней в холодильнике при температуре 2—8 °С.
3. Стандарты B-F восстановленные с концентрациями инсулина 3,0, 10,0, 30,0, 100,0 и 300,0 мкМЕ/мл соответственно: в каждый флакон добавить по 0,5 мл бидистиллированной воды. Хранить до 14 дней при температуре 2—8 °С.
4. Моющий раствор: концентрат моющего раствора растворить в 25 частях бидистиллированной воды.
5. Микротитрационные ячейки: отобрать для исследования необходимое количество стрипов с ячейками. Остальные стрипы поместить в защитный влагонепроницаемый пакет с десикантом.
Ход определения. Для регулярной аналитической процедуры в каждую ячейку микротитрационных стрипов пипеткой вносят по 25 мкл стандартов А—Е, контролей, исследуемой сыворотки (плазмы) крови (для аналитической процедуры широкого диапазона в ячейки вносят по 10 мкл стандартов, A, C—F, контролей, исследуемой сыворотки (плазмы) крови). Добавляют по 100 мкл свежеприготовленного антител-энзимного конъюгатного раствора. Инкубируют ячейки при температуре 25 °С в течение 60 мин, встряхивая в
447
шейкере микротитрационных плашек со скоростью 500—700 движений в 1 мин. Аспирируют и промывают ячейки 5 раз (по 350 мкл моющего раствора), после чего осушают плашку, переворачивая на абсорбирующий материал. В каждую ячейку вносят по 100 мкл ТМБ-хромогенного раствора и инкубируют ячейки в течение 10 мин при комнатной температуре (~ 25 °С), встряхивая в шейкере при 500—700 движений в 1 мин. Добавляют в каждую ячейку по 100 мкл стоп-раствора (0,2 M раствор серной кислоты). Измеряют оптическую плотность растворов каждой ячейки с помощью имму-ноферментного шишечного анализатора при длине волны 450 и 620 нм. Результаты учитывают в течение 30 мин после добавления стоп-раствора.
Перед считыванием абсорбции необходимо установить прибор на «0» соответственно с нулевым стандартом (Blank).
Полученные значения стандартов инсулина используют для построения стандартной кривой, по которой определяют концентрацию гормона в исследуемых образцах.
При работе микропланшетного иммуноферментного анализатора с персональным компьютером и наличии соответствующего программного обеспечения стандартная кривая и результаты исследования проб сыворотки (плазмы) крови высчитываются автоматически.
Примечания. Концентрация стандартов приведена в мкМЕ/мл.
Для перевода в нг/мл необходимо знать: 25 мкМЕ/мл = 1 нг/мл, т. е. мкМЕ/мл • 0,04 = нг/мл. Сыворотка (предпочтительнее) или плазма крови без следов гемолиза. В качестве антикоагулянта используют гепарин. Кровь для получения плазмы центрифугируют (не позднее чем через 15 мин) в центрифуге с охлаждением при 4 °С. Отделяют сыворотку или плазму в пластиковые пробирки с крышками и замораживают при минус 20 или минус 70 °С. В герметически закрытой пробирке инсулин стабилен 1 день при 4—8 °С и 6 мес при минус 20 °С. Уровень инсулина в плазме выше, чем в сыворотке. Клиническое значение. Инсулин секретируется ?-клет-ками островков Лангерганса поджелудочной железы. Инсулин — наиболее важный гормон, регулирующий жировой обмен, и единственный физиологический гормон, обусловливающий снижение уровня глюкозы в крови. Влияние гормона реализуется за мембранным типом — комплекс инсулин-рецептор повышает проницаемость клеточных мембран для глюкозы, обеспечивая этим ее переход из крови в ткани. Инсулин активирует фосфоглюкотрансферазу (гексокиназу) и таким образом обеспечивает превращение глюкозы в глюкозо-6-фосфат с последующим превращением глюкозы в гликоген. Конечным результатом влияния инсулина на обмен углеводов
448
является уменьшение концентрации глюкозы в крови (гипогликемия) и накопление гликогена в мышцах, печени и других органах. При дефиците инсулина клетки теряют способность к использованию глюкозы. Количество ее в крови увеличивается (гипергликемия).
Влияние инсулина на обмен липидов заключается в том, что он обеспечивает использование углеводов для синтеза высших карбо-новых кислот, а из них — липидов. Кроме того, инсулин ингиби-рует тканевую липазу, в том числе и за счет торможения образования цАМФ, и этим сокращает расход липидов. Окисление жиров уменьшается, что приводит к ожирению организма.
