Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
444
шет и инкубируют ячейки в шейкере (встряхивание с частотой 500—700 движений в 1мин) при t ~ 25 °С 10—15 мин. В каждую ячейку дозатором добавляют по 100 мкл стоп-раствора (0,2 M раствор серной кислоты). Встряхивают плашку 5—10 с.
Измеряют оптическую плотность раствора в ячейках при длине волны 450 и 620 нм (в течение 30 мин после добавления стоп-раствора).
Перед считыванием абсорбции необходимо установить прибор на «0» соответственно с нулевым стандартом (Blank).
Полученные значения стандартов кортизола используют для построения стандартной кривой, по которой определяют концентрацию гормона в исследуемых образцах. Пробы, значения которых превышают наивысший стандарт, необходимо дополнительно развести стандартом 0 мкг/дл и повторно исследовать.
Примечание. Все стандарты приведены в мкг/дл. Для перевода в нмоль/л необходимо мкг/дл • 27,6 = нмоль/л.
Клиническое значение. Кортизол вырабатывается корой надпочечников из холестерола. Стимулируется секреция кортизола адренокортикотропным гормоном гипофиза (АКТГ), выделение которого, в свою очередь, активируется гипоталамическим корти-котропным рилизинг-гормоном (КРГ, кортиколиберином). Секреция кортиколиберина контролируется соответствующими центрами головного мозга. Около 90 % циркулирующего в крови кортизола находится в связанном с глобулином состоянии, остальное количество — в свободном.
Кортизол усиливает синтез белка, в печени стимулирует синтез глюкозы из неуглеводистых источников, прежде всего — из аминокислот (глюконеогенез).
При первичной недостаточности коры надпочечников уменьшается синтез глюко- и минералокортикоидов (кортизола и альдостеро-на), при вторичной, обусловленной снижением секреции АКТГ, — глюкокортикоидов. Гипоадренокортицизм чаще встречается у собак, особенно у самок (80 %) молодого или среднего возраста (датский дог, ротвейлер, пудель, терьер).
Гиперфункция коры надпочечников сопровождается увеличением синтеза кортизола и вызывает развитие синдрома Кушинга. Заболевание встречается у собак, чаще у самок среднего возраста. Выраженную генетическую предрасположенность к болезни имеют собаки пород боксер и пудель. В 80—85 % случаев гиперкортицизм у собак развивается вследствие поражения гипофиза (аденома или гипертрофия).
При первичной недостаточности коры надпочечников уровень кортизола уменьшается, а содержание АКТГ по принципу обратной связи — увеличивается (у собак — больше 50 нмоль/л). Диагностика синдрома Кушинга, вызванного аденомой гипофиза, основана на увеличении уровня АКТГ в сыворотке (плазме) крови.
445
При опухолях коры надпочечников синтез кортизола увеличен, а AKTT — уменьшен.
В плазме крови бычков черно-пестрой породы 13—14-месячного возраста, по данным В. П. Радченко (1980), содержится 2,1—4,0 мкг/100 мл кортизола (58,0—110 нмоль/л), у коров на 7—8-м месяцах стельности — 9,8—17,4 нг/мл (Черемисинов с соавт., 1990), за 60-45 дней до отела — 2,9—40,3 (14,1 ± 1,66) нмоль/л, в период половой охоты — 13,3—23,2 нмоль/л (Г. Г. Харута, 1999).
9.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНСУЛИНА В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ (DIAGNOSTIC SYSTEM LABORATORY, США)
Принцип. В основе определения гормона положен принцип энзимсвязанного одношагового сендвичеподобного иммуноанали-за. Стандартные, контрольные растворы и сыворотку (плазму) крови инкубируют с антителами инсулина в микротитрационных ячейках, покрытых другими антиинсулиновыми антителами. После отмывания ячейки инкубируют с тетраметилбензидином и после добавления стоп-раствора определяют степень энзимного оборота субстрата измерением абсорбции при длине волны 450 и 620 нм.
Реактивы: 96 полистириновых микротитрационных ячеек (плашка), на внутренние стенки которых нанесены антиинсулиновые антитела;
стандарты инсулина (лиофилизированные) — 1 флакон (обозначенный А) содержит 0 мкМЕ/мл; 5 флаконов (обозначенных В—F), содержат растворы с концентрациями соответственно 3,0, 10,0, 30,0, 100,0 и 300,0 мкМЕ/мл инсулина в человеческой сыворотке с нертутным консервантом. Стандарты A-E используют при регулярных исследованиях (динамический ряд 3—100 мкМЕ/мл), а стандарты A, C-F — при исследованиях широкого диапазона (10—300 мкМЕ/мл);
контроли инсулина (лиофилизированные) — 2 флакона. Уровни I и II. Содержат высокую и низкую концентрации инсулина в человеческой сыворотке с нертутным консервантом;
инсулиновый антител-энзимный конъюгатный концентрат — 1 флакон содержит 0,3 мл раствора инсулина, конъюгированного с пероксидазой хрена в буфере с нертутным консервантом. Перед использованием растворяют в аналитическом буфере;
аналитический буфер (зеленый) — 1 флакон (28 мл) содержит протеиновый буфер с нертутным консервантом;
ТМБ-хромогенный раствор — 1 флакон (11 мл) содержит тетра-метилбензидин в цитратном буфере с пероксидом водорода;
концентрат моющего раствора — 1 флакон (60 мл) содержит солевой раствор с неионным детергентом;
стоп-раствор — 1 флакон (11 мл) содержит 0,2 M раствор серной кислоты;
446
бидистиллированная вода.
Примечание. Все реагенты и пробы перед исследованием следует привести к комнатной температуре (25 °С) и, осторожно вращая, тщательно перемешать. Сыворотку (плазму) крови хранить не более 24 ч в холодильнике при 2—8 °С. Для более длительного хранения исследуемые образцы замораживают и хранят при минус 20 °С и ниже. Не рекомендуется исследовать гемолизированные и липемичные образцы.
