Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Подготовка реагентов к анализу. 1. Рабочий раствор Т4-ЭНЗИМ-ного конъюгатного концентрата: в чистой посуде развести Т4-ЭН-зимный конъюгатный концентрат (1,0 мл) буфером для приготовления конъюгата (1 : 50). Например, для 96 ячеек необходимо растворить 220 мкл концентрата конъюгата в 11 мл буфера для приготовления конъюгата T/4-энзим (раствор готовят непосредственно перед применением; неиспользованный раствор конъюгата выливают).
2. Моющий раствор: 100 мл концентрата моющего раствора в колбе растворить в 900 мл бидистиллированной воды.
3. Микротитрационные ячейки: отобрать для исследования необходимое количество стрипов с ячейками. Остальные стрипы поместить в защитный влагонепроницаемый пакет с десикантом.
Ход определения. Перед использованием все реагенты и пробы должны быть приведены к комнатной температуре (-25 °С) и тщательно перемешаны. Образцы сыворотки крови, стандарты и контроли рекомендуется исследовать в дублях.
В используемые ячейки микропланшета дозатором вносят по 25 мкл стандартов, контролей и сыворотки крови. Добавляют в каждую ячейку по 100 мкл свежеприготовленного Т^-энзимного конъюгатного раствора (1). Осторожно встряхивают штатив с ячейками 5—10 с, перемешивая содержимое ячеек. Дозатором (лучше многоканальным) вносят в каждую ячейку по 100 мкл бу-
438
ферного раствора с антителами к тироксину. Микротитрационную плашку со стрипами помещают в инкубатор-шейкер для инкубации (t ~ 25 0C) в течение 60 мин, одновременно встряхивая со скоростью 500—600 движений в 1 мин. Используя автоматическое моющее устройство, пятикратно аспирируют и тщательно промывают каждую ячейку моющим раствором (по 350 мкл). Удаляют остатки жидкости с ячеек, переворачивая плашку на фильтровальную бумагу. В каждую ячейку дозатором добавляют по 100 мкл ТМБ-хро-могенного раствора. Закрывают микропланшет и инкубируют ячейки в шейкере (встряхивание с частотой 500—600 движений/мин) при ґ ~ 25 °С на протяжении 10 мин. В каждую ячейку дозатором добавляют по 100 мкл стоп-раствора (0,2 M раствор серной кислоты) для остановки реакции.
Проводят измерение оптической плотности раствора в ячейках при длине волны 450 нм (в течение 30 мин после добавления стоп-раствора).
Полученные значения стандартов T4 используют для построения стандартной кривой, по которой определяют концентрацию тироксина в исследуемых образцах.
Примечание. Для перевода мкг/дл в нмоль/л необходимо мкг/дл • 12,9 = нмоль/л.
Клиническое значение. Тиреоидные гормоны (Т3 и T4) синтезируются в фолликулярных клетках щитовидной железы путем присоединения йода к остаткам молекул аминокислоты тирозина, входящих в состав белка — тиреоглобулина (ТГ), который представляет собой крупный растворимый гликопротеин с молекулярной массой 660 кД. Ежедневная секреция щитовидной железой T4 составляет 80—100 мкг, а Т3 — около 5 мкг.
При необходимости под влиянием протеазы и пептидазы лизо-сом фолликулярных клеток ТГ расщепляется, Т3 и T4 секретиру-ются в кровь, где они связываются с белками плазмы. T4 обладает высоким сродством к глобулину (тиронинсвязывающий глобулин — ТСГ), меньшим — к преальбумину и в небольших количествах связывается с альбумином (соответственно 75 % с ТСГ и 15—20 % — с пре- и альбумином). Лишь 0,05 % T4 остается в свободном (несвязанном) состоянии. Т3 связывается практически только с ТСГ, а относительное количество его свободной фракции составляет 0,5 %. T4 дольше сохраняется в крови — биологический период полужизни его составляет 7—9 дней, а Т3 — 2 дня. Связанные и свободные формы гормонов находятся в динамическом равновесии. Свободные йодтиронины относительно легко проникают сквозь мембрану клеток, влияя на все виды обмена веществ.
Около 85 % циркулирующего в крови T4 дейодируется в печени и почках с образованием почти 80 % суточного количества Т3.
Содержание общего T4 у коров колеблется в пределах 50—100 нмоль/л (В. В. Сахнюк, 2003), T3 — 1,5—2,5, у телят старше 10-дневного возраста соответственно 50—150 и 2,0—3,5 нмоль/л. При
439
клинически выраженном гипертиреозе содержание Т3 и T4 повышено, а при гипотиреозе — снижено (у коров содержание Т3 составляет 0,23—1,9 нмоль/л, T4 — 14,0—52 нмоль/л (В. П. Фасоля, 1996; В. Л. Романюк, 2000). В большинстве случаев уровень Т3 коррелирует с содержанием T4. У телят с врожденным зобом выявлена гиперфункция щитовидной железы. Прежде всего увеличивается содержание T3 (В. Л. Романюк, 2002).
Функция щитовидной железы изменяется при некоторых болезнях внутренних органов: уменьшение содержания ее гормонов установлено при бронхопневмонии телят, остеодистрофии, кетозе и гепатодистрофии коров, т. е. развивается так называемый феномен «нормальной больной щитовидной железы».
В настоящее время наблюдается тенденция к определению свободного T4 у людей как одного из основных маркеров функционального состояния щитовидной железы. В ветеринарии этот тест не нашел еще своего места.
9.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИРЕОТРОПИНА (TTT) В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (DYAGNOSTIC SYSTEM LABORATORY, США)
Принцип. Определение тиреотропина основано на энзимсвя-занном одношаговом сендвичеподобном иммуноанализе. Стандарты, контроли и исследуемые образцы сыворотки крови инкубируют в микротитрационных ячейках, покрытых антит-чТТГ-антите-лами с другими антит-чТТГ-антителами, меченными энзимами пероксидазы хрена (ПХ). После промывания ячейки инкубируют с субстратом тетраметилбензидина (ТМБ), добавляют кислотный стоп-раствор и определяют степень энзимного оборота субстрата путем измерения абсорбции при двойном излучении на длине волны 450 и 620 нм. Показатели абсорбции исследуемых образцов прямо пропорциональны концентрации ТТГ в пробе.
