Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Подготовка реагентов к анализу. 1. Рабочий раствор Т3-энзимного конъюгатного концентрата: в чистой посуде развести T/3-эн-зимный конъюгатный концентрат (1,0 мл) буфером для приготовления конъюгата (1:11). Например, для 16 ячеек необходимо 160 мкл (0,16 мл) конъюгата растворить в 1,6 мл буфера (раствор готовят с небольшим запасом и используют в течение 24 час).
2. Моющий раствор: 100 мл концентрата моющего раствора в колбе растворить в 900 мл бидистиллированной воды.
3. Микротитрационные ячейки: отобрать для исследования необходимое количество стрипов с ячейками. Остальные стрипы поместить в защитный влагонепроницаемый пакет с десикантом.
Ход определения. В используемые ячейки микротитраци-онных стрипов пипеткой вносят по 50 мкл стандартов, контролей, исследуемой сыворотки крови. В каждую ячейку добавляют по 100 мкл свежеприготовленного рабочего раствора T/3-энзимного конъюгатного концентрата. Плашку осторожно встряхивают в течение 20—30 с, затем накрывают ее фольгой и инкубируют 60 мин при комнатной температуре (~25 °С). Промывают ячейки 3 раза, добавляя по 300 мкл моющего раствора. В каждую ячейку вносят по 100 мкл ТМБ-хромогенного раствора. Ставят плашку в темное место и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре («25 °С). Добавляют по 50 мкл стоп-раствора в каждую ячейку и осторожно перемешивают 15—20 с.
Измеряют оптическую плотность растворов каждой ячейки с помощью иммуноферментного плашечного анализатора при длине волны 450 нм. Результаты учитывают в течение 30 мин после добавления стоп-раствора. При возможности для более точного измерения абсорбции необходимо установить прибор на измерение
436
двойного излучения при длине волны 450 нм с последующей перенастройкой на 600 или 620 нм.
Полученные значения стандартов Т3 используют для построения стандартной кривой, по которой определяют концентрацию трийодтиронина в исследуемых образцах. Стандартная кривая должна быть включена в каждое исследование.
При работе микропланшетного иммуноферментного анализатора с персональным компьютером и наличии соответствующего программного обеспечения стандартная кривая и результаты исследования проб сыворотки (плазмы) крови высчитываются автоматически.
9.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕТИРОКСИНА (T4) В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (DIAGNOSTIC SYSTEM LABORATORY, США)
Принцип. Метод основан на ферментном иммуноанализе, в основе которого лежит конкуренция немеченных и меченных ферментом антигенов за определенное количество антигенсвязываю-щих участков антител. Количество фермент-меченых антигенов, связавшихся с антителами, обратно пропорционально концентрации немеченых антигенов исследуемого образца. Показатель абсорбции обратно пропорционален количеству тироксина в пробе.
Реактивы: 96 микротитрационных ячеек (12 стрипов), внутренние стенки которых покрыты козьими антителами к мышиным у-глобулинам;
Т4-стандарты — 1 флакон (1,0 мл), маркированный А, содержит 0 мкг/дл тироксина и 5 флаконов (по 0,5 мл), маркированные В—F, содержат концентрации соответственно 0,5, 1,5, 5,0, 15,0 и 50,0 мкг/дл T4 в человеческой сыворотке с нертутным консервантом;
Т4-контроли — 2 флакона по 0,5 мл каждый. Уровни I и II содержат высокую и низкую концентрации T4 в человеческой сыворотке с нертутным консервантом;
Т4-ЭНЗИМНЫЙ конъюгатный концентрат — 1 флакон из темного стекла (0,3 мл) содержит T4, конъюгированный с пероксидазой хрена в буфере с нертутным консервантом. Растворяют реагент непосредственно перед использованием;
антитела к T4 — 1 флакон (11 мл) содержит мышиные монокло-нальные антитела к T4 в буфере с нертутным консервантом;
буфер для приготовления конъюгата Т4-фермент — 1 флакон (11 мл) содержит белковый буфер с нертутным консервантом;
ТМБ-хромогенный раствор — 1 флакон из темного стекла (U мл), содержащий тетраметилбензидин (ТМБ) в цитратном буфере с водорода оксидом;
концентрат моющего раствора — 1 флакон (105 мл) содержит поверхностно-активные вещества в фосфатно-солевом буферном растворе и консервант. Перед использованием развести в 10 частях дистиллированной воды;
437
стоп-раствор — 1 флакон (11 мл) содержит 0,2 M раствор серной кислоты;
бидистиллированная вода.
Примечание. Все реагенты и пробы перед исследованием следует привести к комнатной температуре (25 °С) и, осторожно вращая, тщательно перемешать. Пониженная температура реагентов и проб дает заниженные результаты оптической плотности. Сыворотку крови можно хранить при 2—8 °С до 7 дней или более длительное время при минус 20 °С. Следует избегать повторного замораживания и размораживания образцов. Не следует использовать образцы с выраженными признаками гемолиза и липемии.
Оборудование: микропланшетный иммуноферментный анализатор Stat Fax-2100, настраиваемый на длину волны 450, 600 или 620 нм; инкубатор-шейкер (встряхиватель) Stat Fax-2200, настраиваемый на 500—600 движений в 1 мин; автоматическое промывающее устройство Stat Fax-2600; полуавтоматические дозаторы объемом 5—50, 50—200 и 200—1000 мкл, наконечники; градуированная лабораторная посуда, полистириновые пробирки; фильтровальная бумага для просушивания стрипов; миллиметровая бумага для построения калибровочного графика (при отсутствии программного обеспечения).
