Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
В колонку количественно переносят упаренный до 5 мл экстракт, дают ему впитаться и элюируют токсины 100 мл смеси хлороформ-ацетон (9:1). Из колбы Бунзена элюат количественно переносят в колбу Эрленмейера на 200 мл и упаривают на водяной бане до 4—5 мл. Упаренный экстракт количественно переносят в мерную пробирку на 10 мл и хлороформом доводят объем до метки (основной раствор). Полученный экстракт используют для тонкослойной хроматографии.
Тонкослойная хроматография. На пластинке отмечают линию старта в 1,5—2,0 см от нижнего края пластинки и наносят 20, 5, 2, 1 и 20 мкл из основного раствора (пробы 1, 2, 3, 4 и 5 соответственно). На ту же пластинку в пятно основного раствора пробы вносят 5 мкл стандартного раствора смеси афлатоксинов и рядом наносят на пластинку пробу стандартного раствора афлатоксинов в количестве 5 мкл (концентрация афлатоксинов В[ и G[ в стандартном растворе должна быть 1 мкг/мл и по 0,5 мкг/мл для афлатоксинов B2 и G2). Пластинку подсушивают на воздухе для удаления растворителя и проводят последовательную хроматографию в двух системах растворителей. Сначала пластинку помещают в камеру, насыщенную парами системы толуол—этилацетат 85%-ная муравьиная кислота (5:4:1). Когда фронт растворителя поднимется на 10 см над линией старта, пластинку вынимают из камеры, подсушивают на воздухе и помещают в камеру с системой хлороформ-метанол (99 : 1) и разгоняют в том же направлении на расстоянии 13 см от линии старта*. Пластинку просматривают в УФ-лучах (365 нм). Rf афлатоксинов B1, B2, Gj и G2 равно соответственно 0,34; 0,29; 0,26 и 0,22.
Вместо системы хлороформ—метанол (99 : 1) можно использовать систему четыреххлористый углерод—ацетон—уксусная кислота (20 : 10 : 1). Rf афлатоксинов в этом варианте будет 0,38, 0,35, 0,33 и 0,29 соответственно для Bi, B2, Gj и G2.
Если в пробе 4 отмечается интенсивная флуоресценция, соответствующая по величине Rf и характеру свечения стандарту, делают разведение основного раствора в 50 раз. Для этого 0,1 мл основного раствора переносят в мерную пробирку на 5 мл и доводят объем раствора до метки хлороформом. Из приготовленного раствора на пластинку наносят 10 и 5 мкл (пробы 6 и 7) и проводят последовательную хроматографию, как описано выше. Концентрацию афлатоксинов определяют по таблице 58.
Для более точного определения афлатоксинов в образце готовят разведение основного раствора в 2, 5 и 10 раз или более и из при-
* Если необходимо определять только афлатоксин B1, хроматографию проводят только в системе толуол—этилацетат — 85%-ная муравьиная кислота (5:4:1).
416
58. Определение концентрации афлатоксинов
Номер пробы, в которой отмечают флуоресценцию
Концентрация В| и G| (мкг/кг)
10-20
> 20
> 50
> 100
> 500
> 1000
готовленного раствора наносят на пластинку постепенно увеличивающиеся в объеме пробы. После разгонки пластинки в хромато-графических камерах ее проявляют в УФ-лучах, отмечая наименьший объем пробы, дающий на пластинке минимальную флуоресценцию. Концентрацию каждого афлатоксина вычисляют по формуле
v= 1,2-200- V Wn '
где X — концентрация афлатоксинов В[ или G\, мкг/кг; 1,2 — коэффициент, учитывающий потери определяемых веществ в ходе анализа; 200 — коэффициент пересчета токсина на 1 кг корма с учетом минимально детектируемых количеств афлатоксина на пластинке; V — конечный объем основного раствора с учетом разведений, мл; W- масса навески образца, соответствующего экстракту, вносимого на колонку, г; и — объем пробы, дающий на пластинке минимальную флуоресценцию, мкл.
Клиническое значение. Обнаружение в кормах афлатоксинов в количествах, превышающих 100 мкг/кг, служит основанием для постановки предварительного диагноза на отравление этими микотоксинами, особенно в случаях отравления уток, индеек, кроликов или форели. Однако окончательный диагноз может быть поставлен по результатам анамнестического расследования (содержание в корме арахисового шрота, кукурузы, ввезенных из тропических стран) и результатов патологоанатомического вскрытия (увеличение печени и почек, гемморагии, отечность, множественные кровоизлияния, некротические очаги в печени).
8.7. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАТРИЯ ХЛОРИДА В ПАТОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ (ПО А. Ф. БАШМУРИНУ, 1968)
Принцип. Метод основан на извлечении натрия хлорида из патологического материала (содержимое желудочно-кишечного тракта, печень) дистиллированной водой, фильтрации экстракта, осаждении поваренной соли серебра нитратом с последующим титрованием из-
27 — 4196
417
бытка серебра в присутствии индикатора — железоаммониевых квасцов.
Pe акт и вы: 0,1 н. раствор серебра нитрата. В колбу на 1000 мл помещают 17,0 г серебра нитрата, добавляют 150—200 мл концентрированной азотной кислоты и доводят объем в колбе до метки дистиллированной водой;
0,1 н. раствор аммония роданида. 7,6 г аммония роданида помещают в колбу на 1000 мл, растворяют в 500 мл дистиллированной воды и доводят объем в колбе до метки водой;
насыщенный водный раствор железоаммонийных квасцов.
