Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
413
костный хроматограф и проводят хроматографирование при скорости подвижной фазы 1,2 мл/мин.
Для количественного определения содержания дезоксинивале-нола в образце предварительно строят калибровочный график на стандартном растворе микотоксина. Для этого 20 мкг дезоксинива-ленола растворяют в 1 мл подвижной фазы (тетрагидрофуран-вода 1:1 по объему) и последовательно вводят в хроматограф в объеме 1, 2,...,10 мкл, что соответствует количественному содержанию микотоксина 20, 40,...,20O нг. Количество дезоксиниваленола в исследуемом образце определяют по высотам пиков стандартных растворов и анализируемых проб.
Расчет содержания микотоксина в мг/кг исследуемого образца проводят по формулам, приведенным для ГЖХ.
Количественное определение афлатоксинов B1 и G1 в кормах. Метод разработан Н. А. Соболевой.
В настоящее время известно четыре основных представителя семейства афлатоксинов (афлатоксины В[, B2, Gi и G2), однако наибольшее санитарно-токсикологическое значение представляет афлатоксин Bj. Продуценты афлатоксинов грибы Aspergillus flavus, A. parasiticus. Гриб A. flavus широко распространен в России, однако оптимальная температура для образования афлатоксинов 25—30 °С, поэтому это микотоксины тропических стран — Индии, Таиланда, Бразилии и других с оптимальными условиями для их образования (высокая влажность и температура). В наибольшем количестве афлатоксины образуются в арахисовых орехах, зерне кукурузы и некоторых других культурах. Значительная часть арахисового шрота, произведенного во влажных зонах тропических стран, контамини-рована афлатоксином Bj.
Афлатоксин Bj относится к классу высокотоксичных соединений с ЛД50 для лабораторных животных 3—5 мг/кг. Особенно чувствительны к нему утки, индейки, форель, кролики. Афлатоксины обладают выраженным гепатотоксическим действием.
Принцип. Метод основан на экстракции токсинов из кормов водным ацетоном, очистке экстрактов от сопутствующих примесей гексаном, переэкстракции токсинов в хлороформ или бензол, их очистке на хроматографической колонке с силикагелем и алюминия оксидом и последующем определении с помощью тонкослойной хроматографии по флуоресценции в УФ-лучах.
Реактивы: ацетон (ч. д. а.);
гексан (х. ч.);
хлороформ для наркоза;
толуол (ч. д. а.);
кислота муравьиная (ч. д. а.);
этилацетат (х. ч.);
натрия хлорид 4 %-ный водный раствор; метанол (х. ч.);
четыреххлористый углерод (х. ч.);
414
кислота уксусная (х. ч.); силикагель КСК; алюминия оксид; натрия сульфат безводный;
стандарт афлатоксина Bi производства ВНИИВСГЭ.
Оборудование: готовые к употреблению пластинки для TCX типа «Силуфол», камера для хроматографирования; УФ-лам-па с длиной волны 365 нм; весы аналитические АДВ-200; микрошприц на 10 мкл; весы технохимические с точностью до 0,01 г; хроматографическая колонка диаметром 1,6 см, длиной 25 см; шуттель-аппарат; колбы мерные на 25, 50, 100 мл; кофемолка; цилиндры мерные на 100 и 500 мл; делительные воронки.
Ход определения. Измельченную пробу массой 50,0 г помещают в колбу на 500 мл с притертой пробкой, заливают 150 мл смеси ацетон-вода (85 + 15). Колбу закрывают пробкой и встряхивают на шуттель-аппарате в течение 45 мин. Полученный экстракт отфильтровывают через бумажный фильтр в мерный цилиндр на 100 мл, отбирая первые 75 мл фильтрата, которые переносят в делительную воронку на 500 мл. Цилиндр ополаскивают 5 мл ацетона и сливают в ту же делительную воронку. К фильтрату приливают 50 мл гексана, закрывают пробкой и энергично встряхивают 1,5—2 мин. Затем в делительную воронку приливают 150 мл 4%-ного раствора натрия хлорида, аккуратно перемешивают содержимое воронки и дают слоям разделиться. После этого нижний водно-ацетоновый слой сливают во вторую делительную воронку и в ней проводят переэкстракцию токсинов из водного ацетона в бензол или хлороформ.
При использовании хлороформа 25 мл его приливают в делительную воронку, аккуратно перемешивают и дают слоям разделиться. После разделения слоев нижний слой фильтруют в колбу на 250 мл через бумажный фильтр со слоем безводного натрия сульфата. Операцию переэкстракции повторяют еще трижды, каждый раз сливая нижний слой в ту же колбу. После этого промывают фильтр 10 мл хлороформа, полученный объединенный экстракт упаривают на водяной бане до 5 мл и используют для очистки на хроматографической колонке.
При переэкстракции афлатоксинов из водного ацетона в бензол в делительную воронку с экстрактом после обезжиривания гексаном вносят 25—30 мл бензола, встряхивают и после разделения слоев нижний слой отбрасывают, а бензольный экстракт, оставшийся в воронке, сливают в колбу на 100 мл. Делительную воронку промывают 10 мл бензола и сливают в ту же колбу. Объединенный бензольный экстракт упаривают на водяной бане, растворяют в 5 мл хлороформа и используют для очистки на хроматографической колонке.
В нижнюю часть хроматографической колонки помещают ватную пробку, вносят силикагель (высота столбика 1 см) и на сили-
415
кагель наслаивают алюминия оксид (высота столбика 2,0—2,5 см), на который помещают слой безводного натрия сульфата высотой 3 см. Колонку по мере наполнения обстукивают для лучшего уплотнения сорбентов.
