Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
26*
403
бы в течение 15 мин. Экстракт фильтруют через ватный тампон в колбу на 200 мл.
Объединенный экстракт пропускают через колонку, которую готовят следующим образом. В нижнюю часть колонки помещают слой ваты (1 см), вносят 10 г алюминия оксида, промывают 20 мл хлороформа и заливают очищенный экстракт. После того как весь экстракт опустится до адсорбента, колонку промывают 100 мл хлороформа, а затем 20 мл ацетона. Зоокумарин элюируют с колонки 50 мл смеси ацетона и 2%-ного раствора натрия гидроксида (47:3). Элюат собирают в фарфоровую чашку № 10, добавляют 0,2 мл ледяной уксусной кислоты и упаривают досуха на кипящей водяной бане. Для определения зоокумарина на спектрофотометре уксусную кислоту не добавляют.
Определение зоокумарина с помощью ТСХ. Сухой остаток после выпаривания растворяют в 0,5 мл ацетона и полностью наносят в одну точку с помощью микропипетки или пипетки Пастера на старт хроматографической пластинки. Одновременно готовят стандарты, внося в фарфоровую чашку 5—10 мкг вещества, что соответствует 0,5—1,0 мл рабочего раствора зоокумарина. Образцы наносят на пластинки в следующей последовательности: стандарт (5 мкг), образец (1-я повторность), образец (2-я повторность), стандарт (10 мкг). Размер пятна не должен превышать 0,5 см2. Места нанесения проб располагают на расстоянии 1,0—2,0 см друг от друга и от нижнего и боковых краев пластинки; пятна не должны погружаться в растворитель.
В камеру для хроматографирования наливают 60 мл смеси гексана и ацетона (2:1) и через 20 мин помещают в нее пластинку в вертикальном положении. Камеру герметично закрывают. Хрома-тографирование проводят при температуре не ниже 20 °С. После того как растворитель поднимется на высоту 8—9 см, пластинку вынимают, отмечают фронт растворителя и помещают в сушильный шкаф при 105 °С на 3 мин. Затем пластинку охлаждают и опрыскивают из пульверизатора проявляющим реагентом, вновь высушивают при тех же условиях и помещают в эксикатор над парами аммиака на 1 мин. Зоокумарин проявляется в виде коричневых пятен на желтом фоне с Rf 0,4—0,5 в тонком слое силикагеля и Rf 0,29—0,35 на «Силуфоле». Количество пестицида в пробе определяют сравнением интенсивности окраски и площади пятна стандарта и образца. В случае если содержание зооцида в пробе превышает 10 мкг, следует получить хроматограмму стандартов большей концентрации (20—100 мкг).
Расчет. Содержание зоокумарина в исследуемой пробе (х, мг/кг) вычисляют по формуле
где А — содержание зоокумарина в исследуемой навеске, мкг; P — масса пробы, г.
404
Определение зоокумарина с помощью ГЖХ. Полученный после выпаривания остаток растворяют в 3 мл метилирующего реагента и переносят в пробирку длиной 15 см, диаметром 1,5 см, содержащую 500 мг безводного калия карбоната. Пробирку закрывают ватным тампоном и выдерживают в водяной бане при 65 °С в течение 15 мин. Затем содержимое переносят в делительную воронку на 100 мл посредством 30 мл дистиллированной воды и 5 мл гексана. Метиловый эфир зоокумарина экстрагируют путем встряхивания делительной воронки в течение 2 мин. Водную фазу отбрасывают, экстракт промывают 15 мл насыщенного раствора натрия хлорида и сливают в сухую пробирку.
В испаритель газового хроматографа вводят 5 мкл экстракта и проводят хроматографирование при следующих условиях: расход газа-носителя 80 мл/мин, поддув 120 мл/мин; температура термостата детектора, колонки и испарителя 250, 225 и 250 °С соответственно; чувствительность электрометра 1 • 10 А; скорость протяжки ленты самописца 1 см/мин; время удерживания метилового эфира зоокумарина 2,5 мин; высота пика при введении в испаритель 10 нг вещества 80 мм; линейный диапазон от 5 до 25 нг.
Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки по градуировочному графику, по высоте пика. График строят в интервале концентраций от 5 до 25 нг зоокумарина. С этой целью в фарфоровые чашки вносят 5, 10 и 20 нг зоокумарина в ацетоне. Ацетон выпаривают, а остаток метилируют, как и пробы. Введение в испаритель хроматографа 5 мкл гексанового экстракта соответствует детектированию 5, 10 и 20 нг зооцида.
Расчет. Содержание зоокумарина в анализируемой пробе (х, мг/кг) находят по формуле
V2P '
где Ск — количество вещества, найденное по градуировочному графику, нг; Vx — объем экстракта, мл; V2 — объем экстракта, вводимого в газовый хроматограф, мкл; P — масса анализируемой пробы, г.
Спектрофотометрическое определение зоокумарина в мышечной ткани животных. Полученный после выпаривания экстракта остаток в фарфоровой чашке растворяют в 4 мл 2%-ного раствора натрия гидроксида, фильтруют через бумажный фильтр в пробирку и измеряют оптическую плотность при 308 нм. Для сравнения используют пробу мышечной ткани здорового животного того же вида.
Расчет. Концентрацию зоокумарина в образце (х, мг/кг) вычисляют по формуле
X = W
VxP '
где С — содержание зоокумарина, найденное по градуировочному графику, мкг; V — общий объем раствора препарата, мл; V\ — объем раствора, взятого для анализа, мл; P — масса анализируемого образца, г.