Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Если параметры выдержаны, то E = -^- = -.
Примечание. Необходимо отработать кинетику фермента, т. е.
продолжительность инкубации. Определение протеиназной активности содержимого рубца.
Принцип. При pH больше 5,0 а-аминокислоты реагируют с нингидрином с образованием углекислоты, альдегида и соединения, окрашенного в синий цвет, которое характеризуется максимальным поглощением при длине волны 597 нм. Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна количеству аминокислот.
Реактивы: фосфатный буфер, pH 7,1;
цитратный буфер, pH 5,4;
2%-ный раствор казеина, приготовленный на 0,5%-ном растворе Na2CO3;
0,5%-ный раствор натрия карбоната; 10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты; 0,01 н. раствор кислоты хлористоводородной (HCl); 60%-ный раствор глицерина;
1%-ный раствор нингидрина (растворяют при подогревании в цитратном буфере; реактив темного цвета необходимо очищать);
раствор «С»: к 40 мл 60%-ного глицерина добавляют 100 мл 1%-нингидрина и 40 мл цитратного буфера (готовят перед анализом).
Ход определения. В одну пробирку (опыт) вносят 4 мл раствора казеина, 1 мл фосфатного буфера и помещают в водяную баню при температуре 30 °С. Через 10 мин добавляют 1 мл разведенного в 5 раз дистиллированной водой содержимого рубца (1 + + 4), смешанного и инкубированного при 30 0C в течение 60 мин. Добавляют 4 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты для прекращения реакции. Взбалтывают 10 мин, центрифугируют или фильтруют (фильтрат должен быть прозрачным).
Набирают 0,2 мл фильтрата или аликвота, добавляют 3,8 мл раствора «С», пробирки закрывают притертыми стеклянными пробками и ставят в кипящую водяную баню на 20 мин.
Пробы, окрашенные в синий цвет, охлаждают в проточной воде и фотометрируют через 10—15 мин на приборе с красным светофильтром в кювете на 10 мм. Интенсивность окраски сохраняется в течение 1 ч.
В контрольную пробирку вносят 1 мл разведенного содержимого рубца, 1 мл фосфатного буфера, 4 мл трихлоруксусной кислоты, выдерживают 10 мин в водяной бане при температуре 30°С. После этого вносят 4 мл раствора казеина, смешивают и фильтруют. Затем исследуют так же, как опытную пробу.
21 — 4196
321
Количество свободного аминного азота определяют по калибровочному графику. Для его построения берут стандартные растворы тирозина или глицина и готовят ряд растворов, которые содержат различное количество этих аминокислот (мкмоль), и дальше реакцию проводят так же, как описано выше. Активность фермента выражают в микромолях аминного азота глицина или тирозина за 1 мин на 1 г ферментного препарата (содержимого рубца), что соответствует 1 ед. активности:
X=^
х В '
где X — активность фермента, мкмоль/л; А — показатель стандартного графика; Б — степень разведения (в 5 раз); В — время инкубации (60 мин).
Источник: 1.
Определение липолитической активности содержимого рубца.
Принцип. Содержимое инкубируют с приготовленной эмульсией подсолнечного масла. Показателем активности ферментов является количество освобожденных свободных жирных кислот. Реактивы: подсолнечное масло;
0,6%-ный раствор цистеина солянокислого или аскорбиновой кислоты; желчь;
20%-ный раствор фосфорновольфрамовой кислоты; 0,01 н. раствор NaOH;
раствор Рингера—Локка: 9 г NaCl, 0,2 г NaHCO3, 0,2 г CaCl2, 0,2 г KCl, 1 г глюкозы и воды дистиллированной до 1 л;
индикатор Таширо: 40 мл 0,1%-ного спиртового раствора метилового красного и 10 мл 0,1%-ного спиртового раствора метиленового синего.
Оборудование: термостат; холодильник; бюретка; колбочки на 100 мл с притертыми пробками.
Ход определения. Содержимое рубца хорошо перемешивают и готовят разведение 1:10. Готовят субстратную смесь: 3 мл подсолнечного масла, 3 мл раствора Рингера—Локка, 1 мл 0,6%-ного раствора цистеина солянокислого и 3 капли желчи.
В колбочки на 100 мл (2 опытные и 2 контрольные) с притертыми пробками набирают по 3 мл раствора Рингера—Локка и 1 мл содержимого рубца. Опытные пробы ставят в термостат при температуре 39 °С на 5 ч, контрольные — в холодильник. Через каждый час пробы встряхивают 5 мин. Через 5 ч добавляют в колбочки по 3 капли 20%-ного раствора фосфорновольфрамовой кислоты и опытные пробы помещают в холодильник. Содержимое колбочек фильтруют в пробирки, добавляют по 1 капле индикатора Таширо. Опытные и контрольные пробы тестируют 0,01 н. раствором NaOH до розового цвета.
Расчет липолитической активности содержимого рубца (ЛА) ведут по формуле
322
где х — липолитическая активность, ед. за 1 ч инкубации; А — количество 0,01 н. раствора NaOH, пошедшего на титрование опытных проб, мл; Б — количество 0,01 н. раствора NaOH, пошедшего на титрование контрольных проб, мл; 5 — время инкубации, ч.
6.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕЙ КИСЛОТНОСТИ СОДЕРЖИМОГО РУБЦА
Общую кислотность содержимого рубца определяют подобно кислотности содержимого желудка или сычуга.
Принцип. К содержимому рубца в присутствии индикатора прититровывают раствор щелочи, что вызывает смену цвета.
Реактивы: 0,1%-ный спиртовой раствор фенолфталеина. 1 г фенолфталеина вносят в колбочку на 100 мл и растворяют 96%-ным этиловым спиртом. Готовый реактив хранят при комнатной температуре;
