Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Ход определения. В пробирке смешивают 10 мл свежевзя-того содержимого рубца и 0,3 мл 16%-ного раствора глюкозы. К концу хлопчатобумажной нити привязывают стеклянный шарик и опускают на дно пробирки с содержимым рубца. Противоположный конец нити фиксируют вокруг внешнего края пробирки. Пробу помещают в термостат при 39 °С и через 12 ч проводят первый контроль. Содержимое рубца переваривает нить в течение 96 ч. Если за это время переваривание не произошло, целлюлолитическая активность считается отрицательной.
Определение амилолитической активности содержимого рубца. Определение амилолитической активности содержимого рубца базируется на принципе расщепления крахмала микробной амилазой; фотоэлектроколориметрический анализ проводится по цветной реакции крахмала и йода.
Реактивы: 6,25%-ный раствор крахмала (готовится непосредственно перед использованием). В колбочку на 250 мл отвешивают 6,25 г водорастворимого крахмала и доливают 80 мл дистиллированной воды. После образования суспензии крахмала колбочку 10 мин выдерживают в кипящей водяной бане (до полного растворения крахмала), часто встряхивая. Раствор крахмала, охлажденный до комнатной температуры, переносят в мерную колбочку на 100 мл и доводят объем кипяченой дистиллированной водой до метки;
фосфатный буфер, рH 6,8;
2 н. раствор хлористоводородной кислоты (HCl);
раствор калия йод-йодистого. Растворяют 20 г калия йодида и 2 г кристаллического йода віл дистиллированной воды.
Оборудование: фотоэлектроколориметр; водяная баня; мерные колбы на 50 мл.
Ход определения. В пробирке смешивают 1,6мл 6,25%-ного раствора крахмального субстрата с 7,4 мл фосфатного буфера. После 10-минутного нагревания пробирки в водяной бане при 40 °С добавляют 1 мл жидкости рубца, процеженной через 2 слоя марли. Содержимое пробирки тщательно взбалтывают и сразу же пипеткой переносят 0,5 мл этой жидкости в мерную колбу на 50 мл с 2 мл 2 н. раствора HCl для прекращения действия микробных ферментов. В колбу добавляют 2 мл раствора калия йод-йодистого и дистиллированной водой доводят объем до 50 мл (проба до инкубации). После этого пробирку выдерживают 1 ч в водяной бане при температуре 40 °С, периодически (через 10—15 мин) перемешивая содержимое пробирки встряхиванием. По завершении инкубации из пробирки отбирают пробу 0,5 мл и переносят в мерную колбочку на 50 мл с 2 мл 2 н. раствора HCl. Добавляют 2 мл калия йод-йодистого и дистиллированную воду до метки (проба после инкубации).
319
Полученные растворы проб до инкубации и через 1 ч после нее исследуют на ФЭКе в кюветах на 5 мм при красном светофильтре (620 нм) против дистиллированной воды.
Расчет. По калибровочной кривой определяют количество крахмала (мг) в растворах до инкубации и после нее. Разница между этими показателями дает количество крахмала, расщепленного микробной амилазой за 1 ч инкубации. Амилолитическая активность выражается формулой
X = (А - В) • 20,
где X — количество крахмала, расщепленного 1 мл содержимого рубца за 1 ч, мг; А — количество крахмала в растворе до инкубации, мг; В — количество крахмала после инкубации, мг; 20 — коэффициент перерасчета на 1 мл содержимого рубца.
Определение активности а-амилазы. Принцип. Определяют количество редуцирующих Сахаров, которые образуются вследствие ферментативного расщепления крахмала. В основу метода положена цветная реакция с 3,5-динитросалициловой кислотой, которая в щелочной среде при наличии редуцирующих Сахаров превращается в З-амино-5-нитросалициловую кислоту и образует раствор желто-померанцевого цвета.
Реактивы: раствор 3,5-динитросалициловой кислоты. 1 г 3,5-динитросалициловой кислоты и 30 г сегнетовой соли растворяют в 20 мл 2 н. раствора NaOH и доводят объем до 100 мл;
2 н. раствор NaOH;
калий-натрий виннокислый (сегнетовая соль); мальтоза (для приготовления стандартного раствора); 1/15 M раствор натрия хлорида; 1%-ный раствор крахмала (субстрат). Оборудование: фотоколориметр.
Ход определения. Жидкость рубца разводят дистиллированной водой в соотношении 1:5. В опытную пробирку наливают 1 мл 1%-ного раствора крахмала и ставят в водяную баню при 39 °С на 1—2 мин. Добавляют 1 мл разведенного содержимого рубца, инкубируют 20 мин. Добавляют 2 мл 3,5-динитросалициловой кислоты для прекращения реакции. В контрольную пробирку набирают 2 мл раствора 3,5-динитросалициловой кислоты, 1 мл разведенного содержимого рубца, а затем 1 мл 1%-ного раствора крахмала и перемешивают. Обе пробирки помещают в кипящую водяную баню на 5 мин, немедленно охлаждают в проточной воде и фотометрируют при 530 нм.
Активность а-амилазы высчитывают по разнице показателей ФЭК между опытными и контрольными пробами, а затем по калибровочному графику определяют количество мальтозы, которая освободилась вследствие ферментативной реакции, по формуле
320
где E — число единиц активности ct-амилазы, выраженное в мг мальтозы; А — количество мальтозы, определенное по графику; P — величина разведения химуса (в 5 раз); 20 — время инкубации, мин.
А ¦ 5 А
